5. 1)、 艰难梭菌630的甲酸脱氨酶-Η(登录号ΥΡ_001089834. 2)、艰难梭菌CD196的甲酸脱氨 酶h(登录号ΥΡ_003216147.1)、Treponema primitia ZAS-2的甲酸脱氨酶Η(登录号 ADJ19611. DXlostridium carboxidivorans Ρ7的甲酸脱氨酶Η(登录号AD012080. 1)、W 及Clostridium ragsdalei的甲酸脱氨酶I (登录号gbIAEI90722. 1)、及其混合物。所有运 些蛋白应被理解为本文所述的伍氏醋酸杆菌蛋白的"同系物"。
[0021] 根据本发明进一步优选的方法，其中所述皿CR是酶复合物的一部分，例如，甲酸 脱氨酶辅助蛋白，例如伍氏醋酸杆菌的F化D;电子传递蛋白，例如伍氏醋酸杆菌的HycBl或 HycB2 ;W及隐含[FeFe]-氨酶特有活性位点的亚基，例如伍氏醋酸杆菌的HydA2。也可优 选的甲酸脱氨酶辅助蛋白和/或电子传递蛋白和/或[FeFe]-氨酶蛋白是在氨基酸水平上 与所述HydA2、F化D、HycBl和/或HycB2酶至少65%，更优选至少70%，更优选至少80%， 最优选至少90 %相同且显示出电子传递活性、甲酸脱氨酶辅助蛋白活性或[FeFe]-氨酶活 性。另外，运些蛋白应被理解为本文所述的伍氏醋酸杆菌蛋白的"同系物"。
[0022] 根据本发明特别优选的方法，其中所述皿CR为包含F化Fl/2、HycBl/2/3和HydA2 的酶复合物的一部分。因此，F化F将C〇2还原成甲酸，电子由Η2-氧化的亚基HydA2提供。 更优选的皿CR是由F化F1/F化F2、HycBl/HycB2、HydA2和HycB3亚基组成的蛋白复合物。 最优选的皿CR选自W下复合物中的一种：含有MhFl、HycBl、HydA2和HycB3的复合物，或 者含有F化F2、HycB2、HydA2和HycB3的复合物。
[0023] 根据本发明进一步优选的方法，其中所述方法还包括对进一步代谢甲酸的细胞代 谢的抑制，例如Na耗尽，如使用钢离子载体的Na耗尽。当细胞的代谢被抑制（和/或受 损）时，所产生的甲酸不能再进一步反应并有利地产生最终产物。对于能量代谢的抑制，可 使用技术人员已知的所有物质，实例选自所有ATP酶抑制剂，例如DCCD(二环己基碳二亚 胺）；重金属，例如银离子、铜离子等；所有膜电位解偶联剂，例如，诸如TCS(3, 3'，4'，5-四 氯水杨酷苯胺）的质子载体、诸如鄉氨霉素的κ-离子载体；作为钻依赖反应抑制剂的舰代 丙烷；减缓ΑΤΡ合成的憐酸饥饿；W及破坏细胞膜完整性的活性剂（tensides)或物质。重 要的是阻断能量代谢的酶和/或步骤，因为运会导致中间产物的累积。由于皿CR独立于能 量代谢且不需要外来的电子载体或能量，形成甲酸的过程可持续进行。运种现象一定能在 全细胞中的反应W及体外反应中应用。发明人还意外地发现，如果化耗尽，乙酷CoA的合 成可W在甲酸处停止。然后该系统（例如细菌）几乎只产生甲酸，可用于储存氨。可W使 用无钢的缓冲液和/或介质，和/或使用钢离子载体来实现耗尽，所述钢离子载体例如，莫 能菌素、短杆菌肤A、或可商购的ET肥120 (N，N，N'，Ν'-四环己基-1，2-苯二氧基二乙酷胺， Selectophore?)等。
[0024] 本发明的另一个方面中，本发明由此基于意外发现通过例如化耗尽（例如使用钢 离子载体）来抑制进一步代谢甲酸的细胞代谢可被有利地用于生产甲酸。在该实施方案 中，所述化耗尽基于有效地阻断甲酸产生下游产物而导致甲酸的累积。本发明由此进一步 设及生产蚁酸（甲酸）的方法，该方法包括：在抑制进一步代谢甲酸的细胞代谢的条件下， 在氨依赖二氧化碳还原酶（皿CR)存在时接触二氧化碳，所述抑制细胞代谢的条件例如：在 化耗尽的条件下、在-300至-600mV的电位（例如，使用电极）的条件下和/或在存在电子 载体的条件下。所述电子载体的浓度可W为5至15mM，电子载体可选自甲基紫精、N，N，-二 乙基-4, 4-联化晚、N，N-二异丙基-4, 4-联化晚、4, 4-联化晚或其混合物。优选地，所述 皿CR选自细菌酶，例如伍氏醋酸杆菌的F化F1或F化F2。更优选地，皿CR是由F化F1/F化F2、 HycBl/HycB2、HydA2和HycB3亚基中的至少一种组成的蛋白复合物。最优选地，皿CR选自W 下复合物中的一种：含有FdhFl、HycBl、HydA2和HycB3的复合物，或者含有FdhF2、HycB2、 HydA2和HycB3的复合物。进一步优选地，所述方法在标准的环境溫度和环境压力下进行， 或在约2(TC至约4(TC和常压下进行。本方法其他优选实施方案是本文所述与本发明第一 方面类似的实施方案。
[00巧]本发明的另一个方面则设及根据本发明的方法，进一步包括用C0脱氨酶和铁氧 化还原蛋白将一氧化碳转化为二氧化碳的步骤，所述C0脱氨酶例如细菌C0脱氨酶，所述细 菌C0脱氨酶例如伍氏醋酸杆菌的AcsA。还可优选的C0脱氨酶是在氨基酸水平上与AcsA 酶至少65 %相同，更优选为至少70 %相同，更优选为至少80 %相同，最优选为至少90 %相 同且显示出C0脱氨酶活性。所有的运些蛋白应理解成本文描述的伍氏醋酸杆菌蛋白的"同 系物"。
[00%] 在本发明的此方面中，还意外地发现了所述酶，即氨依赖二氧化碳还原酶（皿CR) 也可W利用一氧化碳（通过铁氧化还原蛋白）作为C〇2-还原成甲酸的电子供体。因此，运 使合成气能够有利地用于本方法（例如，作为原料）。当然，也可W使用上文描述的"直接" 应用C〇2的复合物和酶在该条件下实施本发明的此方面。此外，本发明方法的此方面也可 W用于从气相中去除C0,因此可W建立净化受C0污染（被C0污染）的气体的方法。
[0027] 因此，本发明的另一个方面设及净化受C0污染或被C0污染的气体的方法，其包括 使用所述受C0污染或被C0污染的气体作为底物，实施根据上述发明的方法。优选地，所述 受C0污染或被C0污染的气体为合成气。
[0028] 在根据本发明的方法中，纯化的（或部分纯化的）酶和细菌细胞均可W使用。因 此，根据本发明的方法可W在体外、体内和/或在培养物中实施，例如在咪挫缓冲液中（参 见下文）。
[0029] 本发明最优选的方法是在生物反应器中W连续操作或W间歇式的操作实施。 其各自的方法和装置为技术人员所熟知且已被描述（例如，Demler和Weuster-Botz; Reactionengineeringanalysisofhydrogenotrophicproductionofaceticacidby Acetobacteriumwoodii.BiotechnolBioeng.2011Feb;108 (2):470-4)。
[0030]因此，本发明的另一个方面设及包含基因修饰的重组细菌生物，其中所述基因修 饰包括用编码蛋白的外源细菌核酸分子来转化所述微生物，所述蛋白包括本文描述的伍氏 醋酸杆菌的F化F1和/或F化F2、F化D、HycBl和/或HycB2、HydA2,W及任选的HycB3或 AcsA，或者其同系物，由此，所述蛋白的表达提高了从C〇2和/或C0和Η2生产甲酸的效率。 更优选地，所述核酸编码皿CR亚基F化F1/F化F2、HycBl/HycB2、HydA2和HycB3中的至少 一种。最优选地，所述核酸编码蛋白F化F1、HycBl、HydA2和HycB3,或蛋白F化F2、HycB2、 HydA2 和HycB3。
[0031] 根据本发明进一步优选的方法进一步包括氨酶成熟基因的（重组）表达W及甲酸 脱氨酶的辅因子生物合成（例如，KuchenreutherJM,Grad}f-SmithCS,Bin曲amAS,George SJ,CramerSP等（2010)化曲-YieldExpressionofHeterologous[FeFe]Hy化ogenasesin Escherichiacoli.PLoSONE5(11):el5491.doi:10. 1371/journal.pone. 0015491 所述）。
[0032] 优选的是本发明的重组细菌生物在本文描述的本发明的方法中的应用。
[0033] 本发明的另一个方面设及氨依赖二氧化碳还原酶（皿CR)在本文描述的本发明的 方法中的应用，所述皿CR例如细菌酶，例如伍氏醋酸杆菌的F化F1或F化F2或其同系物。 优选的应用是，其中所述皿CR是酶复合物的一部分，所述酶复合物具有例如，甲酸脱氨酶 辅助蛋白，例如伍氏醋酸杆菌的F化D;电子传递蛋白，例如伍氏醋酸杆菌的HycBl或HycB2 ; W及隐含[FeFe]-氨酶特有活性位点的亚基，例如伍氏醋酸杆菌的HydA2 ;或它们的同系 物。根据本发明进一步优选的应用，其中所述复合物进一步包含C0脱氨酶和铁氧化还原蛋 白或它们的同系物，所述C0脱氨酶例如细菌C0脱氨酶，所述细菌C0脱氨酶例如伍氏醋酸 杆菌的AcsA。更优选的皿CR是由F化F1/F化F2、HycBl/HycB2、HydA2和HycB3中的至少一 种亚基组成的蛋白复合物。最优选的皿CR选自W下复合物中的一种：含有MhFl、HycBl、 HydA2和HycB3的复合物或含有F化F2、HycB2、HydA2和HycB3的复合物。
[0034] 下文中的附图、序列和实施例仅用于说明本发明，而不应解释为将本发明的范围 限制在实施例描述的本发明的特定实施方案中。就本发明而言，文中引用的所有参考文献 被整体并入本文。
[0035] 图1示出使用全细胞催化进行的甲酸生产。使