苯乙醇胺a半抗原、抗原及其制备方法和应用

苯乙醇胺a半抗原、抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0002] 本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及苯己醇胺A半抗原、抗原、单克隆抗 体制备方法及其应用。
【背景技术】
[0003]目-受体激动剂在现代养殖业中被用于作为饲料添加剂，如之前为人们所熟知的 克伦特罗等，送一类药物可W减少脂肪，增加瘦肉，提高猪的单位经济价值，但是它们都有 危险的副作用，轻则导致必律不整，严重一点就会导致必脏病。
[0004] 苯己醇胺A，又称"克伦己胺"，化学式；2-[4- (4-硝基苯基）了基-2-基氨 基]-1-甲氧基苯己醇，分子式；C19肥4N204,分子量；344,是新一代的瘦肉精。四川省广安 市广安区要山镇畜牧兽医站对某养猪场例行违禁药物监测中，用莱克多己胺测试卡分别检 测母猪、仔猪和育肥猪尿液，发现该场育肥猪尿检呈阳性，之后确认是新型添加物苯己醇胺 A。送种瘦肉精新品种棍现市场，再次敲响中国食品安全警钟。因此被农业部发布的第1519 号公告列为"禁止在和动物饮水中使用的物质"。公告称，根据《饲料和饲料添加剂管理条 例》有关规定，禁止在饲料和动物饮水中使用苯己醇胺A等物质。各级畜牧饲料管理部口要 加强日常监管和监督检测，严肃查处在饲料生产、经营、使用和动物饮水中违禁添加苯己醇 胺A等物质的违法行为。
[0005] 目前，检测苯己醇胺A的方法主要为仪器方法--高效液相色谱质谱法，送类方法 需要专业的仪器设备和专业的人员进行操作，前处理繁杂，费时，不适合大量样本的筛查和 基层人员操作。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快 速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。苯己醇胺A人工抗 原的制备为送一方法的实施奠定了重要基础。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的 特异性与亲和性，送些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计 与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步 骤。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种苯己醇胺A半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应 用。
[0007] 本发明提供的苯己醇胺A半抗原，其结构为式I所示：
式I 本发明还保护式I所示化合物的制备方法，包括如下步骤： 苯己醇胺A138mg溶于IOmlImol/L肥1和4ml二甲基亚讽中；加入 锋粉100mg，8(TC水浴揽拌反应30min，冷却过滤，滤液调抑8.0,20ml己酸己醋萃取2 次，合并有机相，真空干燥；将残留物IOmlDMF溶解，加入碳酸钟60mg，贿己酸82mg，9(TC加 热反应化，降低至室温，加入50ml蒸傭水，IM盐酸调抑6. 0, 50ml己酸己醋萃取2次，合并 有机相，无水硫酸钢干燥，过滤，真空干燥滤液，残留物即为半抗原。
[0008] 本发明所提供的苯己醇胺A抗原，是将苯己醇胺A半抗原与载体蛋白偶联获得的 抗原。
[0009] 所述苯己醇胺A抗原，其结构为式II所示：
本发明还保护所述苯己醇胺A抗原的制备方法，包括如下步骤： 称取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室温揽拌反应化；50mg BSA溶于5ml0.IM碳酸氨钢缓冲液，将上述活化药物逐滴 加入到蛋白溶液中，室温揽拌过夜，PBS4度透析72小时，期间换透析液6 次。将透析液在无菌条件下过0.22Um孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-2(TC保存。
[0010] 同法合成包被原。
[0011] 常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白度SA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲状腺蛋白（TG)或血藍蛋白（KLH)等。
[0012] 所述苯己醇胺A抗原可W作为免疫原制备苯己醇胺A特异性抗体，也可W作为包 被原制备酶柄板。
[0013] 所述抗体具体可为单克隆抗体。
[0014] 式I所示产物、所述苯己醇胺A抗原、所述抗体均可应用于检测苯己醇胺A。
[0015] 本发明还公布了应用苯己醇胺A抗原和苯己醇胺A单克隆抗体制备得到的酶联免 疫试剂盒。
[0016] 所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有苯己醇胺A抗原的酶标板、酶标抗体工作 液、苯己醇胺A系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涂液。
[0017] 本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目 标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物 的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样本中微量小分子目标分 析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低， 半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对苯己醇胺A样品预处理复杂、耗时、且需 要大量有机溶剂萃取，W及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等 缺点。本发明的苯己醇胺A人工抗原，通过免疫动物可产生了针对苯己醇胺A的特异性抗 体，用于快速检测食品中的苯己醇胺A残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特 异性强等诸多优点。
【附图说明】
[0018] 图1为苯己醇胺A酶联免疫检测试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0019]W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置H次重复实验，结果取平 均值。人血清白蛋白简称HSA。
[0020] 实施例1、制备苯己醇胺A半抗原 苯己醇胺A138mg溶于IOmlImol/L肥1和4ml二甲基亚讽中；加入 锋粉100mg，8(TC水浴揽拌反应30min，冷却过滤，滤液调抑8.0,20ml己酸己醋萃取2 次，合并有机相，真空干燥；将残留物IOmlDMF溶解，加入碳酸钟60mg，贿己酸82mg，9(TC加 热反应化，降低至室温，加入50ml蒸傭水，IM盐酸调抑6. 0, 50ml己酸己醋萃取2次，合并 有机相，无水硫酸钢干燥，过滤，真空干燥滤液，残留物即为半抗原。
[0021] 苯己醇胺A半抗原的结构式如式I所示。
[0022] 实施例2、苯己醇胺A人工抗原的制备和鉴定 一、苯己醇胺A免疫抗原的合成 称取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室温揽拌反 应化；50mgBSA溶于5ml0.IM碳酸氨钢缓冲液，将上述活化药物逐滴加入到蛋白溶 液中，室温揽拌过夜，PBS4°C透析72小时，期间换透析液6次。将透析液在无菌条件下过 0.22Um孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-2(TC保存。
[0023] 苯己醇胺A免疫抗原的结构式如式II所示。
[0024] 二、苯己醇胺A包被抗原的合成 称取半抗原IOmg溶于2mlDMF，加入邸C4. 3mg，N服5.Img,室温揽拌反 应化；50mgOVA溶于5ml0.IM碳酸氨钢缓冲液，将上述活化药物逐滴加入到蛋白溶 液中，室温揽拌过夜，PBS4°C透析72小时，期间换透析液6次。将透析液在无菌条件下过 0.22Um孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-2(TC保存。
[0025] 二、苯己醇胺A人工抗原的鉴定 按合成苯己醇胺A免疫抗原和包被抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比 例，分别进行紫外（200nnT400nm)扫描鉴定，并通过比较H者在同一波长下的吸光值计算 其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明半抗原已经与载体蛋白成 功偶联制得苯己醇胺A人工抗原。经计算，苯己醇胺A半抗原分子与BSA分子的结合比为 16.8:1，苯己醇胺A半抗原分子与OVA分子的结合比为11. 5:1。
[0026] 实施例3、酶标单抗的制备和特异性鉴定 一、苯己醇胺A单抗的制备 1、用上述制备出的免疫原按IOOyg/只，W生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体 积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Ba化/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天W免疫原与 弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天W免疫复合物IOOyg/只，不加 弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0027] 2、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬 浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37C，5 %C〇2培养箱中培养，5天 后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0028] 3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细 胞。初选采用间接化ISA方法，W包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和 阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，赔育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和 IgM-HRP,OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争化ISA方法筛选，先将细胞上 清与100yg/mL的苯己醇胺A等体积混合，37C水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板 中。同时用PBS取代苯己醇胺A作对照，其余步骤同上。若经苯己醇胺A阻断后的0〇45。皿 值下降到对照孔的50%W下，则判为阳性，经2^3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法 进行亚克隆化。
[0029] 4、将2^3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接化ISA测定 效价，冻存；并取8~10周龄Ba化/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/只，7~10日后腹腔注射 杂交瘤细胞广2XIO6/只，7^10日后抽取小鼠腹水，离必取上清，测定效价，并冻存备用。
[0030] 二、酶标抗体的制备 (1) 称取辣根过氧化物酶（HRP) 2mg溶解于0.5血水中，加入0.5血0.06mol/L 化1〇4溶液，4°C避光作用30min; (2) 加入160mmol/L的己二醇0. 5mL,室温作用30min; (3) 加入步骤一制备的苯己醇胺A单抗2mg,混匀后装入处理过的透析袋中，置1000 血的0. 05mmol/L碳酸钢缓冲液中透析，4°C过夜； (4) 透析液吸至10血的离必管中，加0. 25血5g/L的NaBH4溶液，混匀后置4°C2h; (5) 加入等体积的饱和硫酸倭溶液，4°C作用30min后4°C下3000r/min离必25min, 弃上清； (6) 将沉淀溶于1. 5血0. 02mol/LpH7. 4的PBS中，吸入透析袋内，在0. 02mol/LpH 7. 4PBS透析，4°C过夜（中途更换PBS3次）； (7) 将透析袋中液体吸至微量离必管中，4°C下100(K)r/min离