，2. 02(m，4H)，1. 62(m，2H)，1. 27(m，1H)，1. 05(d，J = 18Hz，3H)，0· 90(d，J =15Hz，3H).13C-NMR(75MHz，CDCl3):S/ppm = 171·43，169·96，165·59，142·84，141·02， 136. 41,136. 04,135. 84,134. 73,131. 81,128. 61,128. 36,128. 15,127.94,127.53,121. 45, 121. 24,120. 35,116. 51,112. 64,67. 94,67. 02,59. 26,58. 78,57. 64,47. 14,45. 68,40. 62, 28. 91,24. 84,24. 61,23. 55,23. 05。
[0036] 实验例1测定化合物4a，b对肿瘤细胞增殖的抑制作用
[0037] 1)本发明的化合物4a，b用含0. 1 % DMS0的培养基配制成所需浓度。
[0038]2)实验用的肿瘤细胞为!fepG2(人肝细胞癌细胞），HL60(人早幼粒细胞白血病细 胞），Bel-7402 (人肝癌细胞），HT-29 (人结肠癌细胞），HeLa(人宫颈癌细胞），A549 (人肺 癌细胞），S180 (小鼠腹水瘤细胞）和HCCLM3 (人高转移肝癌细胞）。
[0039] 3)实验方法HL-60,HT-29,Bel-7402,A549 和S180 细胞选用RPMI-1640 培养基； !1印62，他1^和!^010细胞选用01^1培养基。培养基中均含10%经灭活的胎牛血清和 1X105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
[0040]贴壁细胞Η印G2,HT-29,Bel-7402,A549,HeLa，HCCLM3 和半贴壁细胞S180 的培 养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3X104个/mL的密度接种于96孔板， 每孔100μL，置于37°C和5%C02的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入 经灭菌处理的化合物5a-c与含0. 1 %DMS0的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加 入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的ΜΤΤ溶 液，置于37°C和5%C02的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL 的DMS0,振荡约lOmin溶解紫色残留物（甲瓒），立即于酶标仪上检测0·D.(吸光度）值， 波长为570nm。
[0041] 悬浮细胞HL60的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5X104个 /mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物 5与含0. 1%DMS0的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶 媒，置于37°C和5%C02的细胞孵育箱中培养48小时。每孔加入25μL浓度为5mg/mL的 MTT溶液，继续置于条件为37°C和5%C02的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min， 小心吸出上清液，每孔加入lOOyLDMSO,振荡约10min溶解紫色残留物（甲瓒），立即于酶 标仪上检测〇·D.(吸光度）值，波长为570nm。
[0042] 按下式求出各个浓度下化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性：
[0043] 细胞增殖（％)=(化合物4a，b组平均0·D.值/对照组平均0·D.值）X100%， 实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC5。（半数有效抑制浓度）值。
[0044] 4)结果见表1。结果表明，在体外细胞毒试验中，化合物4a仅对HL60和S180肿瘤 细胞增殖有明确的抑制作用，而化合物4b则对Bel-7402, !fepG2,HL60,HT-29,HeLa，S180， A549和HCCLM3等8株肿瘤细胞增殖都显示明确的抑制作用。
[0045] 表1化合物4a，b抑制肿瘤细胞增殖的IC5。（均值土SDμM)
[0046]
[0047] 实验例2评价化合物4a，b逆转MCF-7/ADR耐药的活性
[0048] 化合物4a，b均用含1 %DMS0的PBS配制成所需浓度。MCF-7/ADR细胞，采用含 10%胎牛血清的1?^1-1640培养基，在371：、〇)2体积分数为5%的饱和湿度的培养箱中培 养，为维持其耐药性，在传代培养过程中向培养基中加入lmg/L的ADR，实验前3天撤药。
[0049] 将生长状态良好并处于对数生长期的脱药MCF-7细胞以5X104个/mL的密度接 种于96孔板，每孔100μL。在37°C、5%C02孵箱中孵育4小时，按预设的浓度梯度加入经 紫外灭菌的受试化合物和ADR，对照组加入等体积溶媒。继续孵育48小时后，每孔加25μL 浓度为5mg/mL的ΜΤΤ溶液，继续孵育4小时后，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMS0溶 解紫色残留物（甲瓒），平板振荡10分钟使沉淀全部溶解，于570nm酶标仪上测定0D值 (吸光度），波长570nm。按照抑制率=1- [ (RPMI-1640组平均0D值-4a，b组平均0D值）/ RPMI-1640组平均0D值]X100 %计算抑制率。每个化合物重复3次，以抑制率对化合物 4a，b浓度作图，求出IC5。值。
[0050] 化合物4a，b在1μΜ浓度下阿霉素对MCF-7/ADR细胞的逆转倍数如表2,化合物 4a和4b对MCF-7/ADR耐药细胞的逆转倍数分别为3. 72和5. 09,能够有效地逆转MCF-7/ ADR对阿霉素的耐药性。
[0051] 表2化合物在1 μ Μ浓度下阿霉素对MCF-7/ADR的细胞增殖的抑制作用
[0052]
[0054] 实验例3评价化合物4a，b的体内抗肿瘤活性
[0055] 1)本发明的化合物4a，b用0.5%羧甲基纤维素钠配制成混悬液。阳性对照阿霉 素配制成2μmol/kg生理盐水溶液，阳性对照阿糖胞苷配制成8. 2μmol/kg生理盐水溶液。
[0056] 2)化合物4a，b灌胃给药，剂量为1μmol/kg，连续给药7天，共给药7次；阿霉 素腹腔注射，剂量为2μmol/kg，连续给药7天，共给药7次；阿糖胞苷腹腔注射，剂量为 8. 2μmol/kg，连续7天给药7天，共给药7次；0. 5 %羧甲基纤维素钠水溶液灌胃给药，剂量 为0. 2mL/20g，连续7天。
[0057] 3)实验动物为ICR雄性小鼠（清洁级），体重20 ± 2g，每组12只小鼠。
[0058] 4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。
[0059] 5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐 水稀释成（1 : 2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2%台盼蓝染色，混匀 后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞 浓度和细胞存活率。
[0060] 细胞浓度=4大方格内活细胞数/4X104X稀释倍数=细胞数/mL
[0061] 细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数）X100%
[0062] 将存活率大于90%的瘤液用匀浆法制备成2.OX107个/mL的细胞悬液，于鼠腋 皮下接种，0. 2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，各组小鼠每日按照上面的 剂量和给药条件治疗。实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后 用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计 算抑瘤率：抑瘤率％ =(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/阴性对照组平均瘤 重X100%。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以均值土SDg表示。结果见表3。由 表3可以看出，在1μmol/kg的口服剂量下，化合物4a，b治疗组小鼠的瘤重明显小于0. 5% 羧甲基纤维素钠水溶液治疗组小鼠的瘤重，说明它们的有效剂量比发明人发表的1_(乙 基-AA-OBzl) -β-咔啉-3-羧酸苄酯8. 9μmol/kg的有效剂量低8. 9倍。在1μmol/kg的 口服剂量下，化合物4a治疗组小鼠的瘤重与剂量为8. 2μmol/kg的阿糖胞苷治疗小鼠的瘤 重相当，说明它的有效剂量比阿糖胞苷的有效剂量低8. 2倍。在1μmoΙ/kg的口服剂量下， 化合物4b治疗组小鼠的瘤重与剂量为2μmol/kg的阿霉素治疗小鼠的瘤重相当，说明它的 有效剂量比阿霉素的有效剂量低2倍。
[0063] 表3化合物4a，b对S180荷瘤小鼠瘤重的影响（均值土SDg)
[0064]
[0065] η= 12 ;a)与0.5%羧甲基纤维素组比p< 0.01，与阿糖胞苷组比p> 0.05;b) 与0. 5%羧甲基纤维素组及阿糖胞苷组比p< 0. 01，与阿霉素组比p> 0. 05。
[0066] 实验例4测定化合物4a，b的透射电镜照片
[0067] 将化合物4a，b按照5X10 6M的浓度配置化合物的纯水溶液，均匀的铺在铜网上， 在透射电镜（TEM，JEM-1230，JE0L)下观察化合物的自组装性质。得到如图2的照片。结果 表明，化合物4a，b在水中均可形成纳米颗粒，纳米粒径直径在35-124nm之间。
【主权项】
1. 下面结构的1-(乙基-Leu-AA-OBzD-β -咔啉-3-羧酸苄酯，AA为L-Glu和L-Pro 残基。2. 权利要求1的1-(乙基-Leu-AA-OBzl) - β -咔啉-3-羧酸苄酯（AA为L-Glu和L-Pro 残基）的制备方法，该方法包括： 1. L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1，1，3,3_四甲氧基丙烷缩合，得到 (3S)-1-(2,2-二甲氧乙基）-2,3,4,9_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯； 2) 将（3S) -1- (2, 2-二甲氧乙基）-2, 3,4,9-四氢-β -咔啉-3-竣酸节酯用商猛酸钾 氧化，生成1- (2, 2-二甲氧乙基）-3-咔啉羧酸苄酯； 3) 在盐酸，冰醋酸和水体系中1-(2,2_二甲氧乙基）-3-β-咔啉-3-羧酸苄酯转化为 1-(2-氧代乙基）-3-咔啉羧酸苄酯； 4) 将 Boc-Leu 与 L-Glu-OBzl 和 L-Pro-OBzl 偶联得到 Boc-Leu-Glu-OBzl 和 Boc-Leu-Pr〇-〇Bzl ； 5) 在氯化氢-乙酸乙酯溶液中Boc-Leu-Glu-OBzl和Boc-Leu-Pro-OBzl转化为 Leu-Glu-OBzl 和 Leu_Pr〇-〇Bzl ; 6) 将1-(2-氧代乙基）-3-咔啉羧酸苄酯分别与Leu-Glu-OBzl和Leu-Pro-OBzl偶联 得到1-(乙基-Leu-AA-OBzl) - β -咔啉-3-羧酸苄酯（AA为L-Glu和L-Pro残基）。3. 权利要求1的1_(乙基-Leu-AA-OBzD-β -咔啉-3-羧酸苄酯的纳米结构。4. 权利要求1的1-(乙基-Leu-AA-OBzl) - β -咔啉-3-羧酸苄酯在制备抗肿瘤药物中 的应用。5. 权利要求1的1-(乙基-Leu-AA-OBzl) - β -咔啉-3-羧酸苄酯在制备逆转肿瘤药物 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了下式的1-(乙基-Leu-AA-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯，AA为L-Glu和L-Pro残基。公开了它们的制备方法，公开了它们的纳米结构，公开了它们对肿瘤细胞增殖的抑制活性，公开了它们对阿霉素耐药细胞的逆转作用，进一步公开了它们抑制S180小鼠肿瘤生长的活性。因而本发明阐明了它们在制备抗肿瘤药物和制备逆转肿瘤耐药药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/04, A61P35/00, A61K38/05, C07K5/062, B82Y30/00
【公开号】CN105273044
【申请号】CN201410261278
【发明人】彭师奇, 赵明, 王玉记, 吴建辉, 史湘君
【申请人】首都医科大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年6月13日