一株鞘氨醇单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，特别是一株可增强韭菜中残留毒死蜱降解的鞘氨醇单胞 菌（敵was职）及其应用。
【背景技术】
[0002] 毒死蜱（chlorpyrifos)是美国陶氏益农化学公司于1965年研发出来的一种高 效、低毒、广谱、低残留及低抗药性的有机磷杀虫杀螨剂。有效成分的化学名称为〇, 〇-二乙 基-0-(3,5,6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯（0,0-(1丨61:1171-0-(3,5,6-1：1'；[(311101'0-2-pyridyl，phosphorothioate)。毒死蜱在室温及酸性介质中稳定，在碱性介质中则易分解， 难容于水，易溶于大多数有机溶剂。由于高毒有机磷农药被禁用，毒死蜱作为有效的取代 产品，在用量和使用范围上越来越大，在我国广泛应用于水稻防治稻飞虱、水稻螟虫，韭菜 等防治根蛆以及叶菜类蔬菜防治蚜虫、螨类等害虫，如目前田间一般使用48%毒死蜱乳油 500-800倍稀释液灌根，用以防治韭菜根蛆；但是与其他有机磷农药相同，毒死蜱也存在残 留和对生态环境的潜在威胁性，在我国由于大量以及不合理的使用，使得毒死蜱在稻米及 蔬菜中的农残超标，成为发达国家设置绿色贸易壁皇的重要手段，对我国对人民健康产及 农产品出口造成重大的影响。
[0003] 目前毒死蜱在农产品中的去除一般采用清洗和辐照技术，但是这些方法只能清洗 或去除农产品表面的农药残留，同时还有可能造成农产品外观及品质方面的损害。因此，如 何在不损害农产品外观品质的前提下，高效降解残留的农药毒死稗，一直是本领域亟待解 决的问题。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明一株可增强韭菜中残留毒死蜱降解的鞘氨醇单胞菌，在不 影响作物生长及农产品安全的前提下，可提升韭菜对毒死蜱的降解能力，从源头上降低毒 死蜱的在农产品中的残留，本发明是这样实现的： 一株鞘氨醇单胞菌肅wassp.)，其保藏编号为CGMCCNo. 11031 ;所述鞘氨醇 单胞菌菌株为革兰氏阴性，菌体直杆状，带有鞭毛，无内生芽孢。
[0005] 本发明中所提供的鞘氨醇单胞菌在增强韭菜中残留毒死蜱降解中的应用。
[0006] 进一步，本发明所述氨醇单胞菌的应用是指，利用HJY菌剂对韭菜进行浸根处理， 用以增强韭菜中残留毒死蜱的降解； 该HJY菌剂是这样获得的： A) 将保藏编号为CGMCCNo. 11031的鞘氨醇单胞菌接种至LB培养基，30°C划线、挑 单菌落培养两次后，挑取单菌落于菌种活化培养基中，30°C，150-200rpm摇床振荡培养 12-24h，获得活化菌种； B) 向装有种子培养基的发酵罐接种活化菌种，接种量为种子培养基体积的1%， 25-38°C，通空气培养16-24h，得到液体种子； C) 向装有种子培养基的发酵罐接种液体种子，接种量为种子培养基体积的1%， 30-35°C，150rpm下避光培养至对数生长期，得到活菌体培养物； D) 取活菌体培养物50ml于4 °C、5000rpm下离心15min，取沉淀菌体用0. 85%的无 菌生理盐水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至含菌量为lOlfu/mL，即获得HJY菌剂； LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水至1L，121°C灭菌20 min； 菌种活化培养基：胰蛋白胨l〇g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L，121°C灭菌20 min; 种子培养基：K2HP04 4. 8g，KH2P04 3.5g，（NH4)2S04 2g，MgCl2 0.16g，CaCl2 0.02g， Na2Mo04.2H20 0.0024g，FeCl3 0.0018g，MnCl2.2H20 0.0015g，pH=7.0,加水至lL，12rC灭菌 20min〇
[0007] 进一步，本发明所述氨醇单胞菌的应用是指，在韭菜移栽前，将韭菜根浸没于HJY 菌剂稀释液中，浸泡24h后再进行田间移栽；所述HJY菌剂稀释液是由无菌生理盐水将含菌 量为lOlfu/mL的HJY菌剂稀释至含菌量为103-104cfu/mL后获得。
[0008] 相对于现有降解作物中农药毒死稗残留的技术，本发明获得的鞘氨醇单胞菌可长 期定植于韭菜根部，可增强农作物降解残留毒死蜱的活性，在不影响农作物品质的前提下， 高效降解农药残留，绿色无污染，适宜广泛推广使用。
【附图说明】
[0009] 图1为鞘氨醇单胞菌HJY显微镜图； 图2为鞘氨醇单胞菌HJY菌落形貌图片； 其中，（A)为加富培养基培养，（B)为MSM培养基； 图3为16SrDNA系统发育示意图； 图4增强农作物降解毒死稗结果示意图。
【具体实施方式】
[0010] 实施例中所涉及的培养基： LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，去离子水1000mL;121°C灭菌20 min〇
[0011]无机盐培养基（MSM) :0· 4gMgS047H20,0. 2gFeS047H20,0. 2gΚ2ΗΡ04,0· 2g (NH4)2S04,0 . 08gCaS04,去离子水 1000mL，pH7.0-7.2。，121°(：灭菌 20min; 加富培养基（固体，1L): 0.4gMgS047H20,0.2gFeS047H20,0.2gΚ2ΗΡ04,0·2g(NH4)2S04,0 . 08gCaS04，1000mg蛋白胨，1000mg牛肉膏，琼脂 20g，去离子水 1000mL，pH 7. 0-7. 2,121°C灭菌20min，用于菌株的斜面保存和平板培养。
[0012] 菌种保藏培养基（固体，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，加水 至 1L，121°C灭菌 20min。
[0013] 菌种活化培养基(液体，1L):胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1L， 121°C灭菌 20min。
[0014] 种子培养基（液体，1L) :K2HP04 4. 8g，KH2P04 3. 5g，（NH4) 2S04 2g，MgCl2 0· 16g， CaCl2 0.02g，Na2Mo04.2H20 0.0024g，FeCl3 0.0018g，MnCl2.2H20 0.0015g，pH=7.0;121°C* 菌20 min〇
[0015] 实施例1筛选菌株 1、菌株的获得 (1) 样品采集：2012年10月，在江苏省南京市江苏省农业科学院实验田中采集经毒死 蜱选择压力驯化的韭菜新鲜植株样本，用自来水将植株表面附带灰尘泥土冲洗干净，自然 风干，按下述程序进行表面消毒：75%酒精浸泡3-5min，然后用无菌水冲洗3-4次，用2. 5% NaC102漂洗2-5min，最后用无菌水清洗5次； (2) 菌株分离筛选：分别取韭菜根茎叶进行组织研磨，吸取汁液均匀涂布于加富培养 基平板上，于30°C条件下避光培养2-7天。
[0016] (3)菌株富集培养：待长出菌落后，挑取单菌落进一步划线于含毒死蜱的无机盐 培养基（MSM)(毒死蜱含量50mg/L，该培养基以毒死蜱为单一碳源)，于30°C条件下避光培 养2-7天，选取能连续5次在只含毒死蜱（50mg/L)作为唯一碳源的MSM上生长的菌株； (4)菌株纯化：采用平板划线分离法纯化，挑取在最高浓度下(毒死蜱100mg/L)生长的 菌落在富集培养基上划线，直到分离获得纯培养物。
[0017] 经上述方法筛选获得1株高效毒死蜱降解菌，申请人将其自命名为菌株HJY，其生 理生化特征见表1 :
*+代表反应呈阳性，-代表反应呈阴性。
[0018] 菌株HJY显微照片如图1所示，经检测，该菌株为革兰氏阴性，直杆状，带有鞭毛 而无内生芽孢，其在加富培养基(含毒死蜱100mg/L)和LB培养基上生长较快，在加富培养 基(含毒死蜱100mg/L)中菌落生长48h如图2 (A)所示，菌落呈亮黄色，质地光滑，湿润粘 稠；而在以毒死蜱为唯一碳源的MSM平板上(含毒死蜱50mg/L)生长相对缓慢，如图2 (B) 所示，菌落开始时稀薄，呈白色，生长36 h后菌株变为淡黄色，质地光滑粘稠。
[0019] 菌株HJY的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登记号为： KM985687,其16S rDNA系统发育如图3所示，在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/网站上用 blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明其与鞘氨醇单胞菌 5A)相似性最高，可以达到99%以上，因此确定其为鞘氨醇单胞菌。
[0020] 申请人于2015年7月2日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中，国科学院微生物研究 所，邮编100101;其保藏编号为CGMCCNo.11031，分类命名为鞘氨醇单胞菌 sp.〇
[0021] 实施例2制备HJY菌剂 1、 菌种活化：挑取实施例1获