一种突变的多聚半乳糖醛酸酶pg63h95y及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y及 其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 果胶是一类带负电的高分子多糖，广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组 织中，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分。果胶由不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1，4糖 苷键连接而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链，分子量介 于25kD~360kD之间。果胶类物质分为4类：原果胶（protopectin)、果胶（pectin)、果胶 酸（pecticacid,pectate)和果胶酯酸（pectinicacid,pectinate)。果胶酶是分解果胶质 的多种酶的总称，它能将高分子果胶多糖降解为小分子或单体还原糖形式，能够有效降解 果胶，因此果胶酶具有重要的工业应用。按作用机制果胶酶可以分为原果胶酶、解聚酶和果 胶酯酶。解聚酶又可分为果胶水解酶和果胶裂解酶。其中水解酶通过水解作用切割D-半 乳糖酸的α-1，4糖苷键生成寡聚半乳糖醛酸，而裂解酶则通过反式消去作用切断α-1，4 糖苷键生成β-4, 5不饱和半乳糖醛酸，果胶酯酶水解果胶中的甲酯，生成果胶酸。
[0003] 由于果胶酶能够有效降解果胶质，因此成为不同的工业领域中的新兴酶类。国外 对果胶酶的研究始于20世纪30年代至50年代已工业化生产。而国内的研究则始于60年 代，80年代末才开始工业化生产。目前果胶酶在果蔬加工、饲料、纺织和造纸工业都有广泛 应用。随着我国水果种植和水果加工业的发展，食品果胶酶的开发和应用也迅速发展。相 比较而言，果胶酶最重要的应用领域还是食品工业中的果蔬汁生产加工。果蔬汁的混浊主 要是由果胶质引起的。通过果胶酶处理可提高果蔬汁的出汁率和澄清度，果胶酶的应用是 传统果蔬汁加工行业的一次新技术革命，现已成为果蔬汁生产中最重要的酶制剂之一，被 大量应用于果蔬汁的提取和澄清、改善果蔬汁的可过滤性以及植物组织的浸渍和提取。目 前，大部分原果汁、浓缩果汁的生产过程中，都在使用果胶酶，果胶酶已成为重要的工业酶 种。因此，获取具有高催化效率的果胶酶是当前的研发趋势。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y。
[0005] 本发明的再一目的是提供编码上述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y的编码基 因。
[0006] 本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的多聚半乳糖醛酸酶PG63H95Y的基 因工程方法。
[0009] 本发明以来源于Penicilliumsp.CGMCC1669的多聚半乳糖醛酸酶PG63作为 母本，经理性设计和分子生物学技术而获得的催化效率提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体PG63H95Y。涉及到的氨基酸突变点为His95Tyr。
[0010] 所述突变体氨基酸序列如SEQIDN0. 1所示（对多聚半乳糖醛酸酶PG63的95位氨 基酸进行定点突变，His95Tyr)。
[0012] 所述高催化效率多聚半乳糖醛酸酶突变体核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0014] 本发明还是提供一种制备所述多聚半乳糖醛酸酶突变体的方法，其技术方案如 下：
[0015] 1)采用over-lapPCR的方法扩增所述突变体序列片段；
[0016] 2)将上述突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9r上，重组载体命名 pPIC9r-PG63H95Y;将本发明的多聚半乳糖醛酸酶突变体基因插入到表达载体合适的限制 性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最 优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的SnaBI和Notl 限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG63H95Y。
[0017] 3)将突变体重组载体转化宿主细胞，诱导表达，获得突变株，优选所述菌株为大肠 杆菌、酵母菌（毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞等）、芽孢杆菌或乳酸杆菌， 优选将重组表达质粒转化毕赤酵母细胞，得到重组菌株GS115/PG63H95Y。
[0018] 本发明还提供了一种制备所述突变体的方法，包括以下步骤：
[0019] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0020] 2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；
[0021] 3)回收并纯化所表达的突变酶。
[0022] 本发明还提供了上述突变体的应用。
[0023] 本发明提供一种高催化效率的、适合于在食品、饲料工业等领域中应用的多聚半 乳糖醛酸酶。本发明的突变酶最适pH(pH3. 5-4. 0)与最适温度（40-50°C)均与原酶保持相 当的活性范围，催化效率提高47倍，能很好的满足食品、饲料工业等领域中应用的需求，有 着非常广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0024] 试验材料和试剂
[0025] 1、菌株及载体：表达宿主PichiapastorisGS115,表达质粒载体pPIC9r为本实验 室保存。
[0026] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司， 多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购 买得到）。
[0027] 3、培养基：
[0028] (1)LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0
[0029] (2)YH)培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖
[0030] (3)MD固体培养基：2%葡萄糖，1. 5%琼脂糖，1. 34%YNB，0. 00004%Biotin
[0031] (4)MM固体培养基：1. 5%琼脂糖，1· 34%ΥΝΒ，0· 00004%Biotin，0· 5% 甲醇
[0032] (5)BMGY培养基：1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1 %甘油（V/V)，1· 34 %YNB， 0. 00004%Biotin
[0033] (6)BMMY培养基：1% 酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%ΥΝΒ，0· 00004 %Biotin， 0· 5% 甲醇（V/V)