重组ulp1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ulp1激酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种重组ULP1激酶的编码序列、编码 蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 多肽或者蛋白质在大肠杆菌中的融合表达是非常常见的技术，但是为了将目的多 肽或者蛋白从融合蛋白中释放出来，往往需要使用价格不菲的蛋白激酶或者利用内含肽的 自断裂。内含肽的自断裂对目的多肽的N端或C端的第一个氨基酸有偏好性，且断裂效果 不稳定，因此目前主要是使用各类蛋白激酶来切割融合蛋白，从而释放出目的多肽（蛋白 质）。
[0003] 目前常见的切割融合蛋白的蛋白激酶有凝血酶，因子10蛋白，肠激酶，TEV激酶， PreScission激酶，TAGZyme激酶，HRV3C激酶，ULP1激酶。不过考虑到切割产物是否会产生 多余氨基酸、切割效率、以及切割位点的特异性这三方面因素，我们发现只有肠激酶与ULP1 激酶符合该条件。肠激酶是识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys结构，而ULP1激酶却是识别100个 氨基酸的SUM0标签形成的二级结构，因此ULP1激酶具有更好的切割特异性。同时SUM0标 签除了作为ULP1激酶的切割识别位点，也可以做为助溶标签使用，可以减小整个融合蛋白 的长度。综合以上的结论，我们认为ULP1激酶是目前为止最优的蛋白切割酶类，具有最好 的切割活性以及切割位点的特异性。通过调研国内相关专利，我们发现国内还没有ULP1激 酶制备的相关专利。国外相关文献中，虽然有相关报道，但是其制备工艺较为复杂而且纯度 较低。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋 白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0006] 所述重组ULP1激酶的编码序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述质粒含有SEQ ID NO. 1所示的编码序列，优选地，所述质粒为p⑶-ULP1，其全 序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0008] 所述蛋白序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 所述重组ULP1激酶的制备方法包括如下步骤：
[0010] (1)根据大肠杆菌密码子使用偏好，对ulpi(4〇3 621)这部分蛋白所对应的编码基因 进行优化，优化设计并合成后的编码序列如SEQIDNO. 1所示；将SEQIDNO. 1所示的序列 通过酶切方式接入表达载体pCold-II，得到质粒pCD-ULPl;
[0011] 通过分析国内外文献，我们发现来自于酿酒酵母的ULP1激酶一共含有621个氨基 酸，但是只需要保留403-621这一区域的氨基酸，即可保留该激酶对SUM0标签的特异性识 别与切割活性，本发明所涉及的ULP1激酶制备均是指403-621这部分活性区域的制备；
[0012] (2)将质粒pCD-ULPl转入大肠杆菌，37°C倒置培养过夜；
[0013] (3)挑取单菌落至505培养基，于37°C条件下进行种子培养7-9h;
[0014] (4)将种子培养基接入5052培养基，接种量为(λ08-L2%，于16-37°C诱导培 养16 - 72h后离心收集菌体；
[0015] (5)将收集的菌体超声破碎后过镍柱纯化：首先过PBS平衡镍柱，然后用咪唑洗脱 重组的ULP1激酶，再将洗脱出的重组ULP1激酶脱盐并收集保存。
[0016]优选地，步骤（2)所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)，也可以为其他本领域常用 的其他菌种。
[0017] 步骤（3)种子培养时的摇床转速为220rpm。
[0018] 步骤⑷所述离心条件是4°C、5000rpm、离心30min。
[0019] 所述步骤（5)是将收集的菌体用PBS悬浮，然后将悬浮的菌体在功率30%、开5s 停12s条件下超声破碎30min，再将破碎后的菌体于4°C、15000rpm条件下离心30min后过 镍柱纯化。所述咪唑洗脱是用50mM咪唑和200mM咪唑各洗脱一次后再用400mM咪唑洗脱； 然后将洗脱液加入超滤管中，于4°C、5000rpm条件下离心30min进行脱盐。
[0020] 上述 505 与 5052 培养基配方参见ProteinExprPurif41，207-234. (2005)。
[0021] 本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特 别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科 技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0023] 通过使用自动诱导培养基与含有cspA启动子的表达载体相结合的异源表达方 法，实现对UPL1蛋白的高活性的重组表达以及高纯度的富集。该方法在诱导UPL1基因表 达时，无需监测〇D6。。（常规技术中，一般是菌生长到0D值在0. 6附近时加入IPTG进行诱导。 而本发明由于使用自动诱导培养基，既不需要检测诱导时间，也不需要人工在特定时间点 加入诱导物），最后能够通过一步法获得纯度在90%以上的UPL1蛋白。同时该方法在16度 至37度这个温度范围内对ULP1蛋白均有稳定的表达效果，且最终产量均在15mg/L以上。 纯化的ULP1蛋白具有高活性：lul酶在30°C条件下能够切割5ug底物，能够在比较宽泛的 条件下有效的将底物切割。
【附图说明】
[0024] 图1为质粒pCD-ULPl结构示意图；
[0025] 图2为不同温度下重组ULP1激酶的表达分析；其中，图A为ULP1在37度下进行 诱导表达；M，表示的是蛋白marker;泳道1，505培养基的菌体（未诱导组）；泳道2, 5052培 养基诱导培养的菌体（诱导组）；泳道3,超声破碎后离心得到的上清；泳道4,超声破碎后 离心得到的沉淀；泳道5,流穿镍柱后得到的滤液；泳道6, 200mM咪唑冲洗镍柱所洗脱的蛋 白；泳道7, 200mM咪唑冲洗后再用400mM咪唑洗脱得到的蛋白样品；图B为ULP1在16度 下进行诱导表达;M，表示的是蛋白marker;泳道1，505培养基的菌体（未诱导组）；泳道2， 5052培养基诱导培养的菌体（诱导组）；泳道3,超声破碎后离心得到的上清；泳道4,超声 破碎后离心得到的沉淀；泳道5,流穿镍柱后得到的滤液；泳道6, 200mM咪唑冲洗镍柱所洗 脱的蛋白；泳道7,200mM咪唑冲洗后再用400mM咪唑洗脱得到的蛋白样品；箭头所指示的 位置为重组ULP1激酶；
[0026] 图3为重组ULP1激酶在不同环境下的切割效率；其中，Μ为蛋白marker;泳道1 为阴性对照，只有5μg底物，无重组ULP1激酶；泳道2-10,均含有5μg底物，1μ1重组 ULP1激酶；泳道1-7均是采用标准的酶切缓冲液；泳道8-10采用的酶切缓冲体系分别是 Tris-HCl，PBS，去离子水；泳道1，2,8,9,10是标准反应体积，即总反应体积是50μ1 ;泳道 3,4, 5,6, 7 的反应体积分别是 100, 200,400,600, 800μ1。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1重组ULP1激酶的制备流程
[0028] 1、根据大肠杆菌密码子使用偏好，对ULP1(4()3 621)这部分蛋白所