一种不同聚合度κ-卡拉胶寡糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种不同聚合度卡拉胶寡糖的制备方法，尤其涉及通过改变反应条件，获取酶法制备卡拉胶寡糖的方法，制得不同聚合度的卡拉胶寡糖。
技术背景
[0002]卡拉胶(Carrageenan)是从某些红藻细胞壁中提取的一种水溶性线性硫酸半乳聚糖，具有以1，3- β -D-半乳糖和1，4- a -D-半乳糖交替连接形成的骨架结构，其分子量在105?10 6Da，根据是否含有3，6-内醚半乳糖、硫酸根含量及硫酸根所在位置，主要将卡拉胶分为κ -、λ-、τ -三族。
[0003]卡拉胶作为一种天然海藻多糖，因其安全、无毒，可生物降解、自然界存在量大，及其特殊的理化特性而在食品、药品和化妆品等行业大量应用。然而，由于卡拉胶分子量较大，溶解性、吸收性较差，从而影响其生物活性并限制其进一步的应用。研究表明，经降解得到的卡拉胶寡糖生物活性及利用率得到较大提高。
[0004]现有的降解卡拉胶的方式可主要归为三类，分别为化学降解法、物理降解法、酶法降解，化学法降解主要存在反应条件、反应产物难以控制的缺点；物理法降解则存在反应重现性差的缺点；酶法降解可避免上述两类方法存在的缺陷，具有底物专一性强、反应条件温和、反应过程易于控制等优点，具有较强的应用优势。
[0005]目前，关于酶法制备卡拉胶寡糖的研究主要集中在对酶解产物进行分离纯化及其衍生物的制备方面，然后进行生物活性的应用研究，而对卡拉胶寡糖制备的工艺优化方面研究较少。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种不同聚合度卡拉胶寡糖的制备方法。
【发明内容】
[0006]本发明从菌株发酵产物中分离得到一种胞外卡拉胶降解酶，直接作用于卡拉胶，通过调节反应条件，得到平均聚合度范围较大的一系列卡拉胶寡糖，使得本发明制备工艺简单，且能够实现快速、低耗地制备卡拉胶寡糖。
[0007]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
[0008]一种不同聚合度κ -卡拉胶寡糖的制备方法，主要包括以下步骤:
[0009]步骤1:培养基的制备
[0010]人工海水:NaCl28.13g，KC1 0.77g, CaCl2.2H20 1.60g，MgCl.6H20 4.80g，NaHC030.llg，MgS04.7H20 3.50g，蒸馏水 lOOOmL ；
[0011]活化培养基:牛肉膏10g，蛋白胨10g，蒸馏水250mL，人工海水750mL，牛肉膏、蛋白胨溶解于蒸馏水后调pH 7.8，煮沸后调pH 7.3，与人工海水混匀后，121°C，灭菌20min ;
[0012]发酵培养基:NaCl20g，CaCl20.20g，蛋白胨 5.0g，NaH2P04.2H20 1.3g，Na2HP04.12H20 3.82g，卡拉胶 5g，蒸馏水 1000mL，pH 自然，121。。，灭菌 20min ；
[0013]步骤2:将菌种 Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5，该菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号:CICC 23819，先接种于活化培养基中，于18-22°C、180rpm摇床上培养24_26h，进行培养活化；按2_3 %的接种量将菌液接种到发酵培养基中，于18_22°C、180rpm摇床培养36_40h ;将发酵液在4°C条件下，7000-9000rpm冷冻离心15min，取上清液，即得粗酶液；
[0014]步骤3:将酶活为2.5-3.0U/mL的粗酶液按10 %的量加入到卡拉胶溶液中，混匀，进行酶解反应；
[0015]步骤4:改变底物卡拉胶浓度进行酶解反应:
[0016]在所述步骤3中，以浓度为0.05mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，溶解卡拉胶，改变底物卡拉胶浓度，于45°C条件下进行酶解反应，制得聚合度范围为8-15的卡拉胶寡糖；
[0017]步骤5:改变溶液pH进行酶解反应:
[0018]在所述步骤3中，以浓度为0.05mol/L、不同pH的磷酸盐缓冲液，溶解卡拉胶，于45°C进行酶解反应，制得聚合度范围为7-45的卡拉胶寡糖；
[0019]步骤6:改变反应温度进行酶解反应:
[0020]在所述步骤3中，以浓度为0.05mol/L、pH为9.0的磷酸盐缓冲液配置成浓度为12g/L的卡拉胶溶液，于不同温度下进行酶解反应，制得聚合度范围为7-14的卡拉胶寡糖；
[0021]步骤7:改变振荡速率进行酶解反应:
[0022]在所述步骤3中，以浓度为0.05mol/L、pH为9.0的缓冲液配置成浓度为12g/L的卡拉胶溶液，于40°C，不同振荡速率条件下进行酶解反应，制得聚合度范围为6-8的卡拉胶寡糖；
[0023]步骤8:将步骤4至步骤7酶解反应后的反应液，分别加入无水乙醇于4°C冰箱放置过夜，离心，收集沉淀真空冷冻干燥，即分别制得不同聚合度的κ -卡拉胶粗寡糖。
[0024]作为实施例的优选方式，所述步骤4中，改变底物卡拉胶溶液浓度范围为4_14g/L。
[0025]作为实施例的优选方式，所述步骤5中，改变溶液pH范围为6.0-9.5。
[0026]作为实施例的优选方式，所述步骤6中，改变反应温度范围为35_60°C。
[0027]作为实施例的优选方式，所述步骤7中，改变振荡速率范围为0_160rpm。
[0028]本发明采用上述技术方案后，具有以下有益效果:
[0029]1.本发明通过调节反应条件，得到了平均聚合度范围较广的卡拉胶寡糖；
[0030]2.本发明制备方法简单快速，反应条件温和，相对于物理化学方法反应过程易于控制，便于生产应用。
[0031]3.本发明以改变pH的作用效果最为显著，所制得的卡拉胶寡糖聚合度范围为7-45，明显优于传统制备方法。
【附图说明】
[0032]图1底物浓度对卡拉胶酶解反应还原糖生成量的影响；
[0033]图2底物浓度对卡拉胶酶解反应平均聚合度的影响；
[0034]图3 pH对卡拉胶酶解反应还原糖生成量的影响；
[0035]图4 pH对卡拉胶酶解反应平均聚合度的影响；
[0036]图5反应温度对卡拉胶酶解反应还原糖生成量的影响；
[0037]图6反应温度对卡拉胶酶解反应平均聚合度的影响；
[0038]图7振荡速率对卡拉胶酶解反应还原糖生成量的影响；
[0039]图8振荡速率对卡拉胶酶解反应平均聚合度的影响。
【具体实施方式】
[0040]本发明通过发酵菌液获得粗酶液，稀释粗酶液使酶活力在一定范围，再将稀释的粗酶液作用于卡拉胶进行酶解反应，酶解产物以还原糖的生成量来确定。
[0041 ] 还原糖含量测定采用3，5- 二硝基水杨酸法
[0042]标准曲线的制作:称取烘干至恒重的半乳糖0.lg，加蒸馏水定容至100mL，配制成浓度为lmg/mL的标准半乳糖溶液。分别取上述标准液0、0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL于试管中，加蒸馏水补足至0.5mL，然后加入0.5mL DNS，沸水浴反应5min，取出立即冷却，加蒸馏水补足体积至5mL，于波长520nm处测吸光度；样品中还原糖含量的测定同标准曲线的测定方法。
[0043]总糖含量测定采用硫酸-苯酚法
[0044]标准曲线的制作:取lmg/mL标准半乳糖溶液10mL加水定容至100mL配制成浓度为0.lmg/mL的标准半乳糖溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，加水补足至
1.0mL,然后依次加入0.5mL 6 %的苯酚溶液和2.5mL浓硫酸，混匀，室温条件下静置反应30min，于波长590nm处测吸光度；卡拉胶溶液中总糖含量测定同标准曲线的测定方法。
[0045]平均聚合度=总糖含量/还原糖生成量
[0046]培养基的制备:
[0047]人工海水:NaCl28.13g，KC1 0.77g，CaCl2.2H20 1.60g，MgCl.6H20 4.80g，NaHC030.llg, MgS04.7H20 3.50g，蒸馏水 lOOOmL ；
[0048]活化培养基:牛肉膏10g，蛋白胨10g，蒸馏水250mL，人工海水750mL，牛肉膏、蛋白胨溶解于蒸馏水后调pH 7.8，煮沸后调pH 7.3，与人工海水混匀后，121°C，灭菌20min。
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