一种9α-羟基雄烯二酮的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种9α-羟基雄烯二酮（9a-0H-AD)的制备 方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]留体药物作为仅次于抗生素的第二大药物，人们对其的需求量不断增加。留体药 物具有高效的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用，被广泛用于治疗风湿病、心血 管疾病、癌症、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等。此外，留体药物也被用来促进家畜的繁 殖及植物的生长。9α-羟基雄烯二酮是留体激素类药物的重要中间体，利用9a-0H-AD作 为前体物可以合成氢化可的松、17α-0Η黄体酮、依普利酮、β米松、地塞米松、可的松等多 种重要的留体原料药，具有重要的商业价值。
[0004] 目前，国内对9 a -OH-AD的合成者是从4-AD出发，通过多步化学合成得至IJ，反应过 程中存在着化学工艺过程复杂、步骤繁琐、累积产率低、产物成本高、底物消耗大等一系列 问题。目前，以生物转化方法催化合成留体药物越来越受到重视，从天然产物中取得含有 甾体基本骨架的化合物如植物留醇为原料，通过适当的微生物转化来获得。相较于传统化 学合成方法，生物转化具有产率高、专一性强、条件较温和环境友好等多种优势，逐渐成为 医药工业合成留体药物的先进技术手段。近年来，利用微生物法制取9 a -OH-AD的技术得 到充分发展并在工业上得到广泛应用。
[0005] 微生物能在留体的任何位置进行羟化反应，而化学方法除了较易在C17引入羟基 以外，在其他位置都很难引入。留体微生物羟化反应无论在其多样性或重要性方面都是独 特的，因为它能达到其他方法不能达到的部位。它不需要添加任何抑制剂就能有效的降解 植物留醇的侧链产生9α羟基AD，丧失了C1，2脱氢酶的活力，并使C9羟基化。
[0006] 2006年Andor等人在耻垢分枝杆菌mc2155中找到并鉴定了 9a_羟基化酶的基因 ksh;2008年VanderGeize又在菌株SQ1中鉴定了第二个9a_羟基化酶Ksh2 ;德国专利报 道了Mycobacteriumfortuitum转化留醇混合物生产9α羟基AD的过程，将菌种接种于含 有22. 5g留醇混合物及聚丙二醇的2. 5L培养基中，收率为31. 1%。但是，现有技术中微生物 发酵制备9a-0H-AD的生物转化效率较低，工艺复杂。
【发明内容】
[0007] 本发明解决的技术问题在于提供一种9α-羟基雄烯二酮的制备方法，工艺简单， 转化效率较高。
[0008] 有鉴于此，本发明提供了一种9α_羟基雄烯二酮的制备方法，包括以下步骤：将 9α_羟基雄烯二酮高产菌株依次进行菌种活化、一级种子培养、二级种子培养和转化发 酵，所述转化发酵的培养基包括如下成分：留醇、大豆油、玉米粉、KN03、Na2HP04、NaH2P04、 FeS04*7H20、CaCl2、CuS04、尿素、卵磷脂和消泡剂；将转化发酵得到的发酵液静置分层，去除 水层后得到植物油乳化物，蒸发所述植物油乳化物中的水分得到含有9a-OH-AD的植物油 乳液；将所述植物油乳液降温、过滤得粗产品，然后将粗品溶于乙酸乙酯，脱色，提纯、降温 重结晶后得到9α-羟基雄烯二酮。
[0009] 作为优选方案，所述菌种活化的培养基包括以下成分：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨； 更优选的，所述菌种活化的培养基的成分含量为葡萄糖〇. 8~1. 2%，牛肉膏0. 2~0. 4%，蛋 白胨0.4~0. 6%，更优选为，葡萄糖1%，牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%。所述菌种活化的条件优 选为：在30~32°C下，以180~220r/min的转速振荡培养30~60h;更优选为：在31°C下，以 200r/min的转速振荡培养42h。
[0010] 作为优选方案，所述一级种子培养的培养基包括以下成分：酵母粉、葡萄糖、 (ΝΗ4)2ΗΡ04、蛋白胨、NaCl、消泡剂；更优选的，所述一级种子培养的培养基的成分含量为酵 母粉 8~10g/L、葡萄糖 3~5g/L、（ΝΗ4)2ΗΡ04 0· 4~0· 6g/L、蛋白胨 1~L5g/L、NaCl0· 8~L2g/ L、消泡剂0. 08~0. 12ml/L，更优选为：酵母粉9g/L、葡萄糖4g/L、（NH4)2HP04 0 . 5g/L、蛋白胨 1.2g/L、NaCllg/L、消泡剂0.1ml/L。所述一级种子培养的条件为：一级种子培养的接种 量为9~11%，转速为50~70r/min，温度为30~32°C，通风量为35~45m3/h，培养30~60h;更优 选为：一级种子培养的接种量为10%，转速为60r/min，温度为31°C，通风量为40m3/h，培养 46h〇 toon] 作为优选方案，所述二级种子培养的培养基包括以下成分：酵母粉、葡萄糖、 (ΝΗ4)2ΗΡ04、蛋白胨、NaCl、消泡剂。所述二级种子培养的培养基的成分含量优选为：酵母粉 8~10g/L、葡萄糖 3~5g/L、（ΝΗ4)2ΗΡ04 0· 4~0· 6g/L、蛋白胨 1~L5g/L、NaCl0· 8~L2g/L、消泡 剂 0· 08~0· 12ml/L，更优选为：酵母粉 9g/L、葡萄糖 4g/L、（ΝΗ4)2ΗΡ04 0· 5g/L、蛋白胨 1. 2g/ L、NaCllg/L、消泡剂0.lml/L。所述二级种子培养的条件优选为：二级种子培养的接种量 为14~16%，转速为55~65r/min，温度为29~31°C，通风量为170~190m3/h，培养20~30h;更优 选为：二级种子培养的接种量为15%，转速为60r/min，温度为30°C，通风量为180m3/h，培养 Mlo
[0012] 作为优选方案，所述转化发酵的培养基的成分含量为：留醇15~30g/L、大豆油 80~120mL/L、玉米粉7~12g/L、KN03 3~6g/L、Na2HP04 3~8g/L、NaH2P044~7g/L、FeS04.7H20 0· 02~0· 05g/L、CaCl2 0· 04~0· 08g/L、CuS04 0· 1~0· 16g/L、尿素1~L 6g/L、卵磷脂0· 1~0· 4g/ L、消泡剂0· 03~0· 07g/L ;更优选为：甾醇20g/L、大豆油100mL/L、玉米粉10g/L、KN03 4g/L、 Na2HP04 5g/L、NaH2P045g/L、FeS04*7H20 0· 03g/L、CaCl2 0· 06g/L、CuS04 0· 12g/L、尿素1. 2g/ L、卵磷脂0. 2g/L、消泡剂0. 05g/L。所述转化发酵的条件优选为：转化发酵的接种量为 18~22%，转速为170~190r/min，温度为30~32°C，通风量为700~750m3/h，发酵培养60~80h ; 更优选为：转化发酵的接种量为20%，转速为180r/min，温度为31°C，通风量为720m3/h，发 酵培养72h。
[0013] 在得到含有9a-OHAD的植物油乳液的步骤中，优选采用降膜蒸发器除去多余的 水分；得到9a-OHAD的步骤中，优选采用活性炭进行脱色。
[0014] 作为优选方案，所述9α-羟基雄烯二酮高产菌株按照如下方法制备：步骤a)以分 枝杆菌为出发菌株，将菌株在斜面培养基上预培养，然后将预培养后的菌株制备成菌体浓 度为10 7~108个/mL的第一菌悬液，所述分枝杆菌为Mycobacteriumsp. 0211 ;步骤b)对所 述第一菌悬液进行紫外诱变，分离后培养，挑取单菌落进行活化和发酵；步骤c)以紫外诱 变筛选出的菌株制备第二菌悬液，对其进行亚硝基胍诱变，分离后培养，挑取单菌落进行活 化和发酵，筛选后得到9α-羟基雄烯二酮高产菌株。
[0015] 作为优选方案，所述步骤a)具体为：以Mycobacteriumsp. 0211为出发菌株，用无 菌水冲洗Mycobacteriumsp. 0211斜面，冲洗液移入装有玻璃珠的三角瓶中，于31°C、180 r/min条件下振荡培养30min，稀释后得到菌体浓度为107~10s个/mL的第一菌悬液。
[0016] 优选的，所述UV诱变具体为：将功率为15W的紫外灯打开预热20min，将第一菌悬 液置于紫外灯下30cm处，搅拌处理]~5min。
[0017] 优选的，步骤b)中发酵步骤具体为：将活化后的单菌落按15%的接种量接种于发 酵培养基中，底物为20g/L，发酵温度为28°C，转速为180r/min，发酵时间为72-96h。
[0018] 优选的，所述NTG诱变具体为：将NTG用丙酮进行溶解，并用磷酸盐缓冲液配制成 浓度为2~6.Omg/mL的溶液，加入所述第二菌悬液并对其进行水浴处理。
[0019] 优选的，步骤c)中，所述分离后培养步骤具体为：涂皿分离，在31°C下培养3-4天。 步骤c)中，发酵步骤具体为：将活化后的单菌落按15%的接种量接种于发酵培养基，底物为 20g/L，发酵温度为28°C，转速为180r/min，发酵时间为72-96h。
[0020] 作为优选方案，步骤c)中，筛选采用的筛选培养基优选包括：植物留醇1%，硝酸 钾0. 1%，磷酸氢二钾0. 05%，硫酸镁0. 05%，氯化钠0. 05%，硫酸亚铁0. 001%，琼脂2%，pH值 7. 2。
[0021] 本发明优选对诱变后的菌株的转化能力进行测定，采用的液体培养基优选为：葡 萄糖1%、牛肉膏〇. 3%、蛋白胨0. 5%、pH为7. 0-7. 2 ;采用的固体培养基：葡萄糖1%、牛肉膏 〇. 3%、蛋白胨0. 5%、琼脂2%、pH为7. 0-7. 2。采用的种子培养基优选为：酵母粉9g/L、葡萄糖 4g/L、（ΝΗ4)2ΗΡ040 · 5g/L、蛋白胨 1. 2g/L、NaCllg/L、消泡剂 0·lg/L、pH为 6. 8-7. 2。采用的 发酵培养基优选为植物留醇20g/L、大豆油100mL/L、玉米粉10g/L、KN03 4g/L、Na2HP04 5g/ L、NaH2P04 5g/L、FeS04*7H20 0· 03g/L、CaCl2 0· 06g/L、CuS04 0· 12g/L、尿素 1. 2g/L、卵磷脂 0· 2g/L、消泡剂 0· 05g/L，用NaOH调pH为 6. 8-7. 2。
[0022] 本发明优选对分枝杆菌Mycobacteriumsp. 0211进行诱变，获得高产9a-0H-AD 的菌株，利用该菌株对植物留醇进行发酵，极大地提升了底物植物留醇的利用率和产物 9a-OHAD的生成，实现工业化生产。
[0023] 从以上方案可以看出，本发明提供了一种9a-羟基雄烯二酮的制备方法，包括以 下步骤：将9a-羟基雄烯二酮高产菌株依次进行菌种活化、一级种子培养、二级种子培养 和转化发酵；将转化发酵得到的发酵液静置分层，后除水层后得到植物油乳化物，蒸发所述 植物油乳化物中的水分，降温、过滤，脱色，提纯、降温重结晶得到9a-羟基雄烯二酮。本发 明利用微生物发酵法降解植物留醇制备9a-羟基雄烯二酮，与化学合成法相比，减少了环 境污染、简化了生产工艺，使发酵产物9a-羟基雄烯二酮的浓度和纯度均得到提高，提高 了转化效率，为进一步工业化生产奠定了良好的基础。
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【具体实施方式】
[0025] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是 应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的 限制。
[0026] 实施例1 9a-0H-AD高产菌株的获得 菌悬液的制备：对出发菌株Mycobacteriumsp. 0211选择，选择一株底物转化率