一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质的制作方法

一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品微生物技术领域，具体涉及一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物 质。
【背景技术】
[0002] 菌种标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，通过使用菌种标准物质能 够有效保证微生物定量检测高效、准确地运行，但目前国内仅在出入境检验检疫系统内少 数几个局在研制，大部分的标准物质都是靠国外引进。2006年，辽宁出入境检验检疫局所研 制的食品中微生物菌落总数标准物质被批准为国家二级标准物质。该标准物质包含两种研 制方法：一种是以模拟食品实物，添加肠杆菌、沙雷氏菌、芽孢杆菌等具有标准号、可溯源性 的菌株经冷冻干燥制成的：另一种是以鱼粉为基质与上述细菌混合经冷冻干燥制成的，而 我国在食品基质的食源性致病微生物标准物质领域仍是空白，因此研制添加基质的微生物 定量标准物质有重要意义。
[0003] 志贺氏菌（是一类具有高度传染性的肠道致病菌，其广泛存在于各种食 品中。人类对志贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以志贺氏菌作 为指标菌。本发明以志贺氏菌为目标菌，通过添加无菌鸡肉粉，配合冻干保护剂，经冷冻干 燥、不确定度评估以及对特性值进行均匀性检测和稳定性追踪，得到含一定菌数的志贺氏 菌标准物质，并形成了一套食品基质的食源性致病微生物标准物质的制备工艺。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其具有良好的均匀 性，且品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种含鸡肉基质的志贺氏菌标准物质，其制备方法包括以下步骤： 1) 保存液的配制：将志贺氏菌标准菌株冻干粉用志贺氏菌增菌肉汤溶解后，划线接种 于志贺氏菌显色培养基上，36± 1°C下培养20h-48h;然后挑取单菌落接种于志贺氏菌增菌 肉汤中，41. 5±1 °C下培养16h-20h;吸取菌液于无菌离心管中，加入其体积1. 5倍、质量 浓度为40%的无菌甘油，混合，制成保存液；保存液于-20°C存储备用，使用前恢复至室温 (22°C)后祸旋 10s; 2) 基质预处理：将鸡肉剔除脂肪组织后，冷冻干燥至脱水率为75%，然后将脱水鸡肉粉 碎至组织细度为170目，采用6°C〇y辐射灭菌后分装备用； 3) 混悬液的配制：按lg鸡肉基质加入7mL无菌水的比例，将预处理后的鸡肉基质与水 混合成基质悬液，再加入其3倍体积的保护剂，混合制得混悬液； 4) 标准物质的制备：取步骤1)制备的保存液2yL于200mL志贺氏菌增菌肉汤中， 41. 5± 1 °C下进行培养，并利用多功能酶标仪定时取样测定培养液的0D_ηηι值，当0D_ηηι 为0. 270 ±0. 1时停止培养，得新鲜菌液，然后将新鲜菌液按混悬液体积浓度1%加入到步骤 3)制得的混悬液中，于台式恒温振荡器上300r/min摇勾30min，再按2mL/瓶进行分装，其 含菌量为8. 4X102~2. 5X103CFU/mL，最后经冷冻干燥，制得标准物质； 5)检验：将所得标准物质进行菌种鉴定、均匀性验证、定值、稳定性检验，制得成品。
[0006] 步骤1)所得保存液的平均菌数为4. 3X107CFU/mL。
[0007] 步骤2)所用鸡肉需先经检测不含抗生素；所用6°Coγ的辐射剂量为6KGY。
[0008] 步骤3)所述保护剂是将脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸与水按体积比 4:0. 1:1:0. 2:1 混合而成。
[0009] 步骤4)经冷冻干燥后所得标准物质中含菌量为530±24CFU/瓶。
[0010]目前含鸡肉基质的标准物质都存在一个重要的问题，即鸡肉基质难溶于水，这使 得标准物质难以达到满意的均匀性。本发明通过在预处理过程中将鸡肉基质冷冻干燥、粉 碎，使所得标准物质能达到良好的均匀性。同时，本发明所得鸡肉基质的志贺氏菌标准物质 品质稳定、质量可控，适用于微生物高效、准确的定量检测。
【具体实施方式】
[0011] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0012] 材料与方法 1. 1材料与试剂 菌源：宋氏志贺氏菌如/?/?￡^，4了0：25931，购自上海汉尼生物技术有限公司。
[0013] 基质：鸡胸脯肉，购自福建圣农集团，低温运输，-20°C存储备用。
[0014] 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、志贺氏菌显色培养基、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂、 菌落计数琼脂，北京陆桥有限公司。蔗糖(分析纯)，上海试一化学剂有限公司；聚乙烯吡 咯烷酮(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸(优级纯)，上海百赛生物技术有限公 司；德运脱脂牛奶，富祺仕贸易（上海）有限公司。
[0015] 1.2仪器与设备 KD-TBC-300M电子天平，福建科迪技术有限公司；M0DULY0-4K冷冻干燥机(配有真空 栗)，美国edword公司；FW100高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；M37610-33 振荡器，金华雷琪实验器材有限公司；Stomacher3500拍击式均质器，英国SEWARD; SpectraMaxM5多功能酶标仪，MolecularDevices公司；SHKE4450台式恒温振荡器，美国 Thermo公司；VXE380超低温冰箱，J0UAN/德国公司；Vitek2C0MPACT30微生物鉴定仪(配套 GP鉴定卡）生物梅里埃公司；B0X389微生物鉴定仪配套麦氏比浊仪，HACHCOMPANY公司； 5mL西林瓶(配套丁基胶塞)，安徽华欣药用玻璃制品有限公司。
[0016] 1.3 方法 1. 3. 1制备保存液 标准菌株冻干粉用志贺氏菌增菌肉汤溶解后划线接种于志贺氏菌显色培养基， 36± 1°C下培养20h-48h，挑取单菌落接种100mL志贺氏菌增菌肉汤中，41. 5± 1°C下培养 16h_20h;吸取400yL新鲜菌液（0D6M=0. 264)于无菌1. 5mL聚乙稀离心管，再吸取600yL、 质量浓度为40%无菌甘油与之混合，即为保存液；保存液中平均菌数为4. 3X107CFU/ mL，-20°C保存备用。使用前恢复室温至（22°C)后涡旋10s。
[0017] 1· 3· 2菌液0D6。。值对应的菌数范围 加保存液2μL于200mL志贺氏菌增菌肉汤增菌液中，设计10个平行，41. 5± 1°C下进 行培养，并分别于培养8、12、16、18h时利用多功能酶标仪测定培养液的0D_值，同时按照 GB4789. 2-2010《动物源性食品中抗生素类药物残留检测方法：微生物抑制法》进行菌落计 数。
[0018] 1.3.3基质的前处理 鸡肉(无抗生素残留）剔除脂肪组织（因动物脂肪较易氧化酸败，使得干粉质量下降，保 存状态不稳定，因此尽量剔除脂肪)，冷冻干燥后脱水率为73. 029% ;将脱水鸡肉用高速万能 粉碎机粉碎，至基质组织细度为170目，其呈疏松粉末状，易分散于热水中，有少量的沉淀， 6°C〇y辐射剂量选择6KGY，灭菌后按100g/袋分装于自封袋中，于玻璃干燥锅中存储待用。
[0019] 1.3.4保护剂的设计 将脱脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸分别记为M、P、S、T，设计单因素试验，其水平 设计见表1，并选用L9 (34)正交表安排试验，实验设计见表2。每种保护剂配方液加入体积 浓度为1%的新鲜菌液（0D6QQ=0.215)，于台式恒温振荡器上混勾（300r/min，30min)，分别按 2mL/瓶分装于无菌西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表3。以保护率为指标，得出保 护率最高的保护剂配方。
[0020] 保护率况计算公式：
式中：G为冻干前菌数（CFU/mL) ;G为冻干后菌数（CFU/mL) 表1单因素水平设计

1. 3. 5混悬液的配制 将预处理后的鸡肉基质与无菌水混合成基质悬液，再加入保护剂混合后得混悬液。根 据基质脱水率(估为75%)设计混悬液的配制方案，其方法见表4。将新鲜菌液（0D_=0. 270) 按混悬液体积1%添加至混悬液中，于台式恒温振荡器上300r/min振荡30min，2mL/瓶分装 于西林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表5。根据混悬液保护率尽（计算参见公式1) 得出最优配制方式。
[0021] 冻干后样品复原方法：样品于室温（22°C)下放置lOmin，然后加2mL生理盐水涡旋 l〇s，静置lOmin。
[0022] 表4混悬液的配制设计
1. 3. 6混悬液含菌数的确定 1. 3. 6. 1冻干样品含菌数短期下降率 按照1. 3. 5得出的最优混悬液配制方式配制lOOmL混悬液，根据保护率馬及新鲜菌液 含菌数，设计混悬液含菌数(添加混悬液体积1%的菌液)。充分混匀后按2mL/瓶分装于西 林瓶中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数见表5。
[0023] 冻干后样品于-20°C条件保存，并分别于0、7、14、28、40天时取样计数，计算冻干 样品菌数的短期下降率疋。
[0024] 菌数下降率疋的计算公式为：
式中：G为冻干后当日菌数（CFU/瓶)；为-70°C条件下存储η天后的菌数（CFU/瓶)；疋为第η天菌数下降率（％) 1. 3. 6. 2混悬液菌数的确定 标准物质含菌数预期值为：200~600CFU/瓶(即100~300CFU/mL)。根据保护率爲及 计算混悬液最小含菌数K及最大含菌数/2。
[0025] 最小含菌数?；的计算公式为：
则添加新鲜菌液的量应保证混悬液含菌数< /2。
[0026] 1. 3. 7批量制备标准物质冻干样品 按照上述工艺流程制备6个批次，每批次100个样品，共计540个样品，批次编号为：SH1~SH6,固定铝盖后存于-20°C待测。
[0027] 1.3.8志贺氏菌的验证 对制备后的冻干样品利用VITEK2程序进行志贺氏菌的鉴定。
[0028] 1. 3. 9均匀性验证 按随机表抽样，每批样品抽取15瓶，在控制同样实验条件下进行检测样品的含菌数 (CFU/瓶)，对结果进行方差分析。
[0029] 1. 3. 10冻干样品的定值 定值结果表示为：标准值土总不确定度。标准值参考1. 3. 8结果。
[0030] 1. 3. 10. 1菌落总数计数方法的不确定度评估 将新鲜培养菌液根据〇D6。。值估计浓度约为2. 0X10sCFU/mL~3.OX10sCFU/mL，稀释至 适当浓度，吸取lmL于平板计数，平行两次，以结果的对数值进行验证，用合并样本标准差 来评估计数带来的不确定度。