一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定多花黄精的方法及其专用引物对。
【背景技术】
[0002] 多花黄精（Polygonatumcyrtonema)是百合科黄精属的植物，是中国的特有植物， 作为常用补益药，其药用历史已达2000余年之久，多花黄精主产于四川、贵州、湖南、湖北 等地生长于海拔500米至2100米的地区，一般生于灌丛、林下和山坡阴处其味甘性平，入 肺、脾、肾三经，有补气润肺、养阴、健脾益肾的功效。临床上用于脾胃气虚，营养不良、肺虚 燥咳，精血不足等症。
[0003] 2010年版《中国药典（一部）》规定作为黄精药用的有3种基源植物，分别为黄 精（PolygonatumsibiricumRed)、多花黄精（PolygonatumcyrtonemaHua)和漬黄精 (PolygonatumingianumColl,etHemsl·)。为保证用药安全，人们使用过多种方法对多花 黄精进行真实性鉴定，然而多花黄精及其伪品的形态和化学成分高度相似，且传统形态学 和化学鉴别常受到人为或环境因素的影响。但目前已报导的多花黄精的分子鉴别方法往往 表现为重现性差、操作复杂、周期长等缺陷，不能满足实际需要，因此迫切需要建立快捷而 简便的真伪品鉴定方法，以保障多花黄精临床用药的安全。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题如何快速、简便的鉴定多花黄精。
[0005] 为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于鉴定多花黄精的引物对。
[0006] 本发明所提供的用于鉴定多花黄精的引物对，可由引物DH-1F和引物DH-2R组成， 所述引物DH-1F和所述引物DH-2R均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列 1和序列2。
[0007] 上述用于鉴定多花黄精的引物对中，所述引物DH-1F和所述引物DH-2R的摩尔比 可为1:1。
[0008] 上述用于鉴定多花黄精的引物对的应用，可为如下al)-a6)中任一种：
[0009]al)制备用于检测或辅助检测多花黄精的试剂盒；
[0010] a2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；
[0011]a3)制备用于鉴定或辅助鉴定多花黄精的试剂盒；
[0012]a4)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精；
[0013]a5)制备用于鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性的试剂盒；
[0014]a6)鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。
[0015] 本发明还提供了用于鉴定多花黄精的试剂盒。
[0016] 本发明所提供的用于鉴定多花黄精的试剂盒含有上述用于鉴定多花黄精的引物 对。
[0017] 本发明还保护上述用于鉴定多花黄精的试剂盒的制备方法，可包括将上述用于鉴 定多花黄精的引物对的各引物分别单独包装的步骤。
[0018] 上述用于鉴定多花黄精的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。上述用于鉴定 多花黄精的试剂盒的应用可为如下bl)或b2)或b3):
[0019]bl)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有多花黄精；
[0020] b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精；
[0021]b3)鉴定或辅助鉴定市售多花黄精的真伪性。
[0022] 本发明还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有多花黄精的方法，可包括 如下步骤：提取待测样品的总DNA，采用上述用于鉴定多花黄精的引物对进行PCR扩增，如 果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有多花黄精；如果不能实现有效扩 增，则所述待测样品中不含有或候选不含有多花黄精。所述待测样品可为中药材，或，所述 中药材的基源植物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
[0023] 本发明还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为多花黄精的方法，可包括如下 步骤：提取待测样品的基因组DNA，采用上述用于鉴定多花黄精的引物对进行PCR扩增，如 果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为多花黄精；如果不能实现有效扩增，则所 述待测样品不为或候选不为多花黄精。所述待测样品可为中药材，或，所述中药材的基源植 物，或，取自所述中药材的基源植物的组织或器官。
[0024] 本发明还提供了一种鉴定市售多花黄精的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取 市售多花黄精的基因组DNA，采用上述用于鉴定多花黄精的引物对进行PCR扩增，如果能够 实现有效扩增，则所述市售多花黄精为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售 多花黄精为或候选为伪品。
[0025] 上述任一所述方法中，所述"能够实现有效扩增"可为PCR扩增产物中含有 300-400bp的DNA片段。
[0026] 上述任一所述方法中，所述"不能实现有效扩增"可为PCR扩增产物中不含有 300-400bp的DNA片段。
[0027] 所述300-400bp的DNA片段可为330bp的DNA片段。
[0028] 所述330bp的DNA片段具体可为序列表中序列3所示的DNA片段。
[0029] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度可为58°C~62°C。
[0030] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的退火温度具体可为58°C。
[0031] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94°C5min; 94°C45s，58°Clmin，30 个~40 个循环；72°C7min。
[0032] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的扩增程序具体可为94°C5min; 94°C45s，58°Clmin，35 个循环；72°C7min。
[0033] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的待测样品的基因组DNA的浓度 可为 10ng~200ng。
[0034] 上述任一所述方法中，进行所述PCR扩增时，采用的待测样品的基因组DNA的浓度 具体可为l〇〇ng。
[0035] 上述任一所述中药材可为多花黄精（Polygonatumcyrtonema)和/或玉竹 (Polygonatumodoratum(Mill.)Druce)和/或小黄精（PolygonatumuncinatumDiels)和 / 或苦黄精和 / 或马铃薯（Solanumtuberosum)和 / 或红薯（Ipomoeabatatas(L. )Lam.) 和 / 或山药（DioscoreaoppositaThunb.)和 / 或生姜（ZingiberofficinaleRoscoe) 和 / 或芋头（Colocasiaesculenta(L. )Schoot) 〇
[0036] 利用本发明提供的鉴定多花黄精的方法及其专用引物对能够快捷而简便的鉴定 多花黄精，以保障多花黄精临床用药的安全，具有重大的推广前景和应用价值。
【附图说明】
[0037] 图1为多花黄精及混渚品的基因组DNA。
[0038] 图2为通用引物对PCR扩增凝胶电泳图。
[0039] 图3为特异性PCR引物对的特异性检测。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0041] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0044]本实施例中的多花黄精（Polygonatumcyrtonema)、玉竹（Polygonatum odoratum(Mill. )Druce)、小黄精（PolygonatumuncinatumDiels)、苦黄精、马铃薯 (Solanumtuberosum)、红墓(Ipomoeabatatas(L. )Lam.)、山药(Dioscoreaopposita Thunb.)、生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)以及芋头(Colocasiaesculenta(L.) Schoot)均为在采集地采集。采集信息见表1。各中药材均符合中国药典（2010年版）一 部正文各药材项下的有关规定，通过鉴定，各位中药材实物与名称相符，质量符合标准。
[0045] 表1.实验材料信息表
[0048] 实施例1、制备用于鉴定多花黄精的试剂盒及其使用方法
[0049] -、用于鉴定多花黄精的引物对的设计与合成
[0050] 从GenBank查找多花黄精及混淆品的psba-trnh序列和测序结果，使用BioEdit 软件进行序列分析，校对和对比，找出多花黄精特有的变异位点，发现多花黄精114bp处为 C，而其他混淆品为T，410bp处正品多花黄精为A，而其他混淆品为C。根据多花黄精特有的 变异位点设计并合成用于多花黄精鉴定的大量PCR引物对。
[0051] 对获得的大量PCR引物对依次进行筛选、效果验证、特异性验证和灵敏度验证，最 终获得一对特异性、灵敏度最佳的引物对如下：
[0052]引物DH-1F:5' -TGTATTAAGAATCGTTGAAGGAGTC-3'（序列表中序列 1);
[0053]引物DH-2R:5' -AGCTAATCATTTATCGAGAAAAATT-3'（序列表中序列 2)。
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