一种免疫细胞库构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种建立细胞库的构建方法及应用，特别涉及一种免疫细胞库的构建方法及应用。
技术背景
[0002]外科手术、化疗、放疗是治疗恶性肿瘤的常用手段，这些治疗方法有一定的侵袭性，会损伤正常细胞，毒副作用大。免疫细胞治疗肿瘤，能特异性杀伤肿瘤细胞，而不会损伤正常细胞，毒副作用小，因而被称为抗肿瘤治疗的第四种方法。
[0003]免疫细胞治疗肿瘤的程序是，首先采集肿瘤患者静脉血，送到细胞工厂，分离静脉血中的免疫细胞，加入免疫细胞培养液，以及重组人白细胞介素2、r干扰素，CD3单克隆抗体等细胞因子激活免疫细胞，放置于C02培养箱中(或者生物反应器)培养，免疫细胞开始增殖，2-3周后，免疫细胞可增殖数百倍到一千倍，免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力也大大增强，杀伤性免疫细胞⑶3+⑶56+双阳性细胞比例由1%?2%上升到30%以上，最高可以达到50%，最后收集免疫细胞，通过一系列严格的检测后，将扩增的免疫细胞回输给肿瘤患者，免疫细胞在肿瘤患者体内发挥杀伤肿瘤细胞的作用，从而达到治疗肿瘤的目的。
[0004]2010年，美国FDA批准了世界上第一个免疫细胞治疗前列腺癌的药物，经过512例的临床试验，可以使前列腺癌患者生存期延长4个月。国内很多医院也开展免疫细胞治疗肿瘤的临床研究，广西医科大学肿瘤医院报道，采用⑶3单克隆抗体、白细胞介素2等激活的免疫细胞，治疗23例小细胞肺癌，有效率78%，1年生存率82%，明显高于对照组的有效率35%，1年生存率47%。
[0005]但是，现有的免疫细胞治疗肿瘤的制备程序存在缺陷，因为，治疗肿瘤的免疫细胞来自肿瘤患者，肿瘤患者的免疫细胞功能受损，杀伤肿瘤细胞能力低下，尽管采用CD3单克隆抗体、白细胞介素2等细胞因子激活，免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力获得增强，但是依然低于健康人免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力。科学研究也证明这一点。有学者比较了肿瘤患者和健康人静脉血免疫细胞，经过CD3单克隆抗体、r干扰素、白细胞介素2等细胞因子激活后，第14天，肿瘤患者的免疫细胞扩增95倍，低于健康人145倍；肿瘤患者免疫细胞杀伤肿瘤细胞株K562的能力是44%，低于健康人的62%。这说明，现有的免疫细胞治疗的程序并不是最优的方案。
[0006]为了克服免疫细胞治疗肿瘤过程中，免疫细胞来自肿瘤病人杀伤肿瘤细胞功能低下的缺点；因此，在健康状态下，将高质量的免疫细胞储存起来，建立免疫细胞库，待将来患肿瘤时用于自体免疫细胞治疗，是一种可行的方法。
[0007]目前，建立免疫细胞库的方法有2种，一是采用淋巴细胞分离液提取静脉血中的免疫细胞，其原理是淋巴细胞分离液的比重是1.077，静脉血中的红细胞比重大于1.077，免疫细胞(单个核细胞和淋巴细胞)的比重低于1.077，所以，通过离心，离心机转速为每分钟1800-2000转，时间20分钟，红细胞会沉淀，免疫细胞会浮在淋巴细胞分离液面上，这样就把免疫细胞分离出来。这种方法的缺点是，(1)免疫细胞回收率低，低于80% ；(2)离心转速每分钟高达1800-2000转，对免疫细胞有损伤。
[0008]另外一种方法是，采用血细胞分离机免疫细胞。这种方法的缺点是，1.血细胞分离机及其耗材价格昂贵，单采一次免疫细胞成本高达2000元；2.单采免疫细胞需要给健康人输入大剂量抗凝剂(1000mL以上)，有相当大的副作用，不适合60岁以上的老人，以及14岁以下的儿童；3.单采免疫细胞耗时长，大约2小时以上，1个工作日只能采集2个病人或者健康人，不适合大量人群使用。
【发明内容】
[0009]为了克服免疫细胞建库中，现有的分离免疫细胞方法的缺点，本发明的目的在于提供一种6%羟乙基淀粉生理盐水溶液分离免疫细胞建库的方法及应用，6%羟乙基淀粉生理盐水溶液是临床常用药品，用于失血病人补充血容量，羟乙基淀粉与静脉血混匀后，羟乙基淀粉中和红细胞膜负电荷，红细胞聚集，沉淀，免疫细胞不会沉淀，从而分离出免疫细胞。
[0010]本发明的技术方案概述如下:
[0011](1)采集健康人静脉血50-100mL，肝素抗凝，取其中静脉血5mL，检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、厌氧菌培养、需氧菌培养、血细胞三分类检测、免疫细胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8检测。
[0012](2)步骤⑴所获得的静脉血，按照质量/体积比1: 1/4的比例，加入1/4体积的生理盐水，充分混匀。
[0013](3)步骤⑵所获得的生理盐水稀释的静脉血，按照质量/体积比1: 1/4?1/5的比例，加入1/4?1/5体积的6%羟乙基淀粉生理盐水溶液，充分混匀。
[0014](4)步骤(3)所获得的含羟乙基淀粉的静脉血稀释液，置4°C离心，离心机转速为700?800转/分钟，时间为8?10分钟。静脉血稀释液分2层，下层沉淀是红细胞，上层是血浆，血浆层中含有大量的免疫细胞，收集上层。
[0015](5)步骤(4)所获得的免疫细胞血浆，再离心，离心机转速为1000?1300转/分钟，时间10?15分钟，免疫细胞沉淀，弃上清，即获得免疫细胞。
[0016](6)步骤(5)获得免疫细胞中，加入冷冻保护剂，经过程序降温，降温速率为-1°C?-3°c /分钟，温度降至-80°c?-90°c后，置于液氮中冷冻保存，并建立可供检索的免疫细胞信息档案，即构建人免疫细胞库。
[0017]其中，冷冻保护剂是含10% (体积百分比)二甲基亚砜免疫细胞培养基，该培养基是由90 %的(体积百分比)无血清免疫细胞培养基和10 % (体积百分比)10 %白蛋白构成。
[0018]以上全过程均在无菌环境中进行操作。
[0019]本发明所获得的免疫细胞，解冻后，免疫细胞活力达到90 %以上，按照免疫细胞浓度0.5?lX106/mL，接种于塑料培养袋，用无血清免疫细胞培养基，加入白细胞介素2、r干扰素、⑶3单克隆抗体，10%白蛋白，置37°C，5%二氧化碳培养箱中培养，免疫细胞开始扩增，每培养3?4天检测免疫细胞数量，添加新鲜免疫细胞培养基，使免疫细胞终浓度0.5?1 X 106/mL, 20天后，免疫细胞扩增800?1000倍，在原始免疫细胞接种10X 106情况下，可收集高达1 X 101°免疫细胞，用于临床治疗肿瘤。
[0020]本发明所述的一种免疫细胞库构建方法，可以从健康人静脉血中获得免疫细胞，建立免疫细胞储存库，根据本发明的方法，储存于库内的免疫细胞，可以经过激活、扩增、获得大量具有强大杀伤肿瘤细胞的能力，用于治疗自身肿瘤。并且，能够长时间保存而不丧失活性，操作简便，建库成本低，具有应用前景。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例中，所用的原料或者试剂除特别说明外，均为市售可得。
[0022]实施例1
[0023]免疫细胞分离:
[0024](1)采集健康人静脉血50-100mL，肝素抗凝，取其中静脉血5mL，检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、厌氧菌培养、需氧菌培养、血细胞三分类检测、免疫细胞⑶3、⑶4、⑶56、⑶8检测。
[0025](2)步骤⑴所获得的静脉血，按照质量/体积比1: 1/4的比例，加入1/4体积的生理盐水，充分混匀。
[0026](3)步骤(2)所获得的稀释静脉血，按照质量/体积比1: 1/4?1/5的比例，加入1/4?1/5体积的6%的羟乙基淀粉生理盐水溶液，充分混匀。
[0027](4)步骤(3)所获得的含羟乙基淀粉的静脉血稀释液，置4°C离心，