一种从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取高纯度甜叶菊糖苷的方法，具体涉及一种适用于工业生产的从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法。
【背景技术】
[0002]甜叶菊原产于巴拉圭的Amambay及Mbaxacayu山脉，属糖科植物，整个生长期温度都在20 °C以上，具有喜温性。1970年日本从巴西引进甜叶菊，开始驯化、栽培、制苷，同时进行毒理、食品检验等试验，并首先开发利用甜叶菊产品一一甜叶菊糖苷。我国于1976年由从日本引种，试种，并获成功，80年代初向全国各地推广种植。
[0003]甜菊苷是一类主要存在于甜叶菊叶片中的四环二萜类衍生物，主要包括甜菊苷(Stev1side)、莱鲍迪苷 A (Rebaud1side A)，莱鲍迪苷 B (Rebaud1sde B)，莱鲍迪苷 C(Rebaud1side C)等8种糖苷，其甜度大约是蔗糖的300倍。有研究表明，甜叶菊糖苷具有高甜度，低热量，无明显毒副作用的特点。它可抑制高血糖、高血压、并有消炎、抗肿瘤，止泻利尿以及协助免疫调节的作用。目前，南美、日本和中国已经把甜叶菊糖苷作为一种天然的甜味剂广泛应用于食品和饮料中。
[0004]现有甜叶菊糖苷的提取方法主要有蒸煮法、冷水浸泡法、发酵法、电解法、超声提取法等。蒸煮法、冷水浸泡法、超声提取法是工业上应用最广泛的一种方法，但其在提取甜叶菊糖苷的同时，也将大量的杂质提取了出来；而生物发酵法、电解法会在提取液中引入外来杂质，给后续工序的纯化分离带来困难。现有甜叶菊糖苷的纯化方法主要有制备色谱、有机溶剂萃取重结晶法等。工业制备色谱化投入大，操作难度大；而有机溶剂萃取重结晶法存在溶剂使用量大、产品收率低等缺陷。
[0005]CN101062077B公开了一种同时制备甜叶菊总甜菊苷和甜叶菊总黄酮的方法，是将甜叶菊干叶用有机溶剂提取，后用超临界流体萃取法、柱色谱法来获得高纯度甜菊苷产品。但是，由于其提取采用了有机溶剂法，成本高，且安全系数低，后期纯化分离采用超临界、柱色谱存在投资大、操作难度大等缺陷。
[0006]CN101805768B公开了一种高品质甜菊糖生物酶解提纯方法，是采用酶提，大孔树脂纯化，溶剂萃取，重结晶得到高纯度产品，且在结晶过程中大量使用无水乙醇。其缺陷是不适合工业规模化生产，收率低、成本高。
[0007]CN102199177A公开了一种纯天然高纯度甜菊糖的生产方法，是采用酶解后超声波连续逆流提取技术进行提取，然后用膜过滤来澄清物料，再用多功能模拟移动床分离系统进行吸附，乙醇洗脱，得到产品。但是，所得产品的纯度最高只能达到96%，且终产品单一，产品回收率低，不适合工业化生产。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种工艺简单，能耗低，环保无污染，适宜工业化生产，产品收率高、纯度高的从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法。
[0009]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:一种从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法，包括以下步骤:
(1)加酶浸泡:将甜叶菊原料粉碎后浸泡于水中，加入纤维素酶制剂进行酶解，得甜叶菊酶解液；
(2)加热浸提:将步骤(1)所得甜叶菊酶解液加热浸提，冷却至室温，离心，过滤，得甜叶菊加酶浸提液；
(3)絮凝除杂:将步骤(2)所得甜叶菊加酶浸提液进行水浴加热，加入无机盐絮凝剂，搅拌，进行絮凝处理后，离心，过滤，得甜叶菊除杂液；
(4)大孔吸附树脂脱色纯化:将步骤(3)所得甜叶菊除杂液过大孔吸附树脂柱进行脱色吸附，再用洗脱液洗脱，洗脱液进行纳滤，浓缩，得甜叶菊浓缩液；
(5)硅胶层析柱分离:将步骤(4)所得甜叶菊浓缩液上硅胶层析柱，然后用乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂进行洗脱，分别收集各馏分，浓缩，干燥，得多种高纯度的甜叶菊糖苷产品。
[0010]步骤(1)中，所述甜叶菊原料中甜叶菊糖苷的质量含量为:甜菊苷4?5%，莱鲍迪苷A 5?6%，莱鲍迪苷C 0.5?1.0%，总糖苷为10?12%。
[0011]进一步，步骤(1)中，所述甜叶菊原料粉碎后的粒径为10?30目，所述甜叶菊原料与水的料液质量比为1:10?12，所述纤维素酶制剂的添加质量(g)为加入的水体积(mL)的0.1?0.3w/v% (优选0.15?0.20w/v%)o若浸泡用水量低于10倍，则糖苷收率会急剧下降，而用水量高于12倍以后糖苷收率几乎无增加，再继续增加用水量无意义；所述纤维素酶制剂的加入，有利于甜叶菊原料细胞壁的破碎，从而利于各类糖苷的溶出，但若添加量小于0.1 w/v%会导致酶解效果急剧下降，而添加量高于0.3 w/v%也无明显效果提升，继续增加酶用量只会损耗酶制剂。
[0012]进一步，步骤(2)中，所述浸提的温度为40?50°C (优选43?46°C)，浸提的pH值为5.0?6.0，浸提的时间为60?70min。由于加热浸提时需要同时保证酶试剂的活性和浸提效率，发明人研究发现，在所述提取温度、pH值下浸提效果最佳，而当提取时间大于60min后，浸提效率趋于平稳状态，收率几乎不增加，继续延长提取时间无意义。
[0013]进一步，步骤(3)中，所述水浴加热的温度为60?80°C (优选68?72°C)，所述絮凝处理的pH值为8?9，絮凝处理的时间为30?40min。发明人研究发现，当水温在50?80°C、pH值为8?10时，絮凝效果基本在同一水平线上，但絮凝损失率有较大差异，在所述温度和pH下絮凝损失率最低；絮凝时间越长，损失率越大，为保证收率、絮凝效果的平衡，絮凝时间为30?40min最佳。
[0014]进一步，步骤(3)中，所述无机盐絮凝剂的添加量为3.0?4.0g/L。絮凝剂添加越多，无疑会损失越大，当添加量达到4.0g/L时，损失率出现拐点，损失率急剧上升，而絮凝效果在4.0g/L后无明显提升，当添加量低于3.0g/L时絮凝效果不能达到絮凝目的。
[0015]进一步，步骤(3)中，所述无机盐絮凝剂为壳聚糖，或者为氯化铁和氧化钙的混合物；所述氯化铁和氧化钙的混合物中，优选氯化铁与氧化钙的质量比为1:0.2?1.5 (更优选1:0.25?1.20)。所述氯化铁和氧化钙的混合物絮凝效果好，价格低廉，添加量少，符合工业生产的需要，且氯化铁絮凝后可以满足在流动过程中产生剪切力的要求，在所述质量比下，絮凝溶液略显碱性，利于絮凝。
[0016]步骤(2)中，所述离心优选三足沉降离心，其转速为1000?1500转/min ;步骤(3)中，所述离心优选卧螺离心+碟式离心串联，卧螺离心转速为2500?3500转/min，碟式离心转速为5000?7000转/min。
[0017]进一步，步骤(4)中，所述脱色吸附的吸附流速为2?3BV/h，脱色吸附的pH值为7.5?8.5，大孔吸附树脂柱的高径比为5?9:1。吸附流速超过3.5BV/h时上柱流出液开始有甜味，表明流速快发生了泄漏，但若流速太慢会造成吸附效率太低。在脱色吸附过程中，采用高效液相色谱仪连续检测甜叶菊除杂液过柱后的流出液，当检出甜叶菊糖苷时，换柱吸附。
[0018]进一步，步骤(4)中，所述洗脱液为体积分数60?65%的乙醇溶液，洗脱的流速为0.5?2BV/h，洗脱液的用量为1?2BV。所述洗脱的温度为室温。发明人研究发现，体积分数60%的乙醇溶液即可将吸附在树脂上的产品全部洗脱下来，工业上为降低乙醇溶液配制的难度，优选体积分数60?65%的乙醇溶液。
[0019]步骤(4)中，所述大孔吸附树脂为AB-8、DC-7、D101、D301或KB-9。优选购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司的D101型大孔吸附树脂和购于山东鲁抗的AB-8型大孔吸附树脂。所述大孔吸附树脂优选先进行活化前处理:先将树脂用体积分数为95%的乙醇溶液浸泡后装柱，用4?8BV柱床体积，体积分数为95%的乙醇溶液以0.2?0.3BV/h的流速清洗，直至流出的乙醇加水不浑浊为止，以清洗出残留的苯乙烯、二乙烯苯、甲苯、二甲苯等树脂合成的材料、交联剂、制孔剂等，用水洗尽柱中乙醇，