一种降低牛乳蛋白βLG免疫反应性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种降低牛乳蛋白0LG免疫反应性的方法。
【背景技术】
[0002] 乳品加工，热处理的主要目的是通过灭菌延长产品的保质期。其主要参数工业：加 热溫度和加热时间。为了保持牛奶营养，热处理有不同的方法。因为牛奶复杂的组合物，不 同的热处理牛奶的蛋白质，蛋白质的机制出性质的变化热处理的不同影响复杂。目前，如何 改变牛奶的致敏机制热处理不是很清楚。
[0003]PLG具有热稳定性，热治疗期间的变化是非常复杂的，会加快蛋白质的结构在高 溫松动，并可能导致内部蛋白质的疏水基团暴露，琉可能发生硫醇基之间的二硫键和成彼 此的聚合物内的分子和分子间的非共价键和共价键的相互作用 。运种聚合物在一定程度上可能消除并覆盖PLG蛋白质过敏的表位，因此，它减少了 过敏性。同时，在牛奶系统中，加热也可W使收集PLG和QLA和CNS-起发生，也可W收 集使蛋白质的表位被掩蔽，从而降低过敏PLG。
[0004] 乳品加工己氏杀菌是必要的链接导致改变加热0LG结构，而其生理功能它也可 引起损坏：无行为能力的蛋白质结合的疏水性分子，如维生素A;牛奶感官品质也有不好的 影响(如"烹调味道")。因此，如果过度热处理可能会导致奶PLG的变性而蛋白质功能的丧 失。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种降低牛乳蛋白0LG 免疫反应性的方法的技术方案。
[0006] 所述的一种降低牛乳蛋白PLG免疫反应性的方法，其特征在于在抑2-10条件 下，将PLG和EGCG结合。
[0007] 所述的一种降低牛乳蛋白0LG免疫反应性的方法，其特征在于0LG在溫度120°C 预热后，在抑2-10下将0LG和EGCG结合。
[0008] 所述的一种降低牛乳蛋白0LG免疫反应性的方法，其特征在于用抑为2-10的 PBS溶剂，将0LG稀释为1%，再与摩尔比为1 :50的EGCG在25°C下水浴比。
[0009] 所述的一种降低牛乳蛋白0LG免疫反应性的方法，其特征在于用抑为2-10的 PBS溶剂，将0LG稀释为1%，在120°C下油浴lOmin，再与摩尔比为1 :50的EGCG在25°C下 水浴比。
[0010] 所述的一种降低牛乳蛋白0LG免疫反应性的方法，其特征在于抑为4. 5-6. 4。
[0011] 所述的一种降低牛乳蛋白PLG免疫反应性的方法，其特征在于PLG和EGCG结合 后在4°C下用SkDa半透膜对反应后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
[0012] 本发明为降低牛乳蛋白PLG免疫反应提供了一种新的方法，其W更有效，更合理 地利用牛奶蛋白，为低过敏性的乳制品发展的新思路路和理论支持。
【具体实施方式】
[0014] W下结合实施例来进一步说明本发明。 实施例
[001引1PLG多克隆抗体的制备与鉴定 1.1实验方法 1.1.1多克隆抗体制备： 将2只3个月、体重1. 5公斤的纯种新西兰大白兔进行实验。连续=天确定正常身体 状况后进行免疫。在几十微克到十微克每千克体重范围内设置免疫剂量，经皮肤和肌肉注 射抗原。首次免疫时将抗原溶于弗氏不完全佐剂和生理盐水乳化后免疫。分别在第3、4、5、 6次免疫后十天，通过兔子耳朵边缘静脉取血进行效价检测。血清抗体达到一定程度后由 颈动脉取全血，离屯、取血清，抗血清的纯化参照DEAE-Se地aroseEF阴离子交换层析柱说明 书，于零下二十摄氏度保存。
[0016] 1. 1. 2间接ELISA方法的建立 W天然牛乳PLG作为包被抗原，通过棋盘法(纵向包被抗原，按10, 5. 0, 2. 5,1. 25， 0.625,0. 313,0. 156,0. 078,0. 039,0. 020yg血1的浓度包被，横向抗血清按 1 :1000,1 : 2000,1 :4000,1 :8000,1 :16000,1 :32000倍数稀释)建立化ISA方法，W免疫前新西兰大白 兔血清为阴性对照。用酶标仪测波长450nm出的吸光值OD，取阳性/阴性（P/N值）最大时 的抗原、抗体稀释度作为抗原、抗体的最佳工作浓度。检测时WP/N〉2.1 (即多克隆抗体上 清的吸光值大于阴性血清值大的2倍)判定检测结果为阳性，P/N值<2.1(即多克隆抗体上 清的吸光值小于阴性血清的2倍）判定检测结果为阴性。
[0017]1.1. 3抗体效价的检测 抗体效价用建立的间接化ISA方法测定，同时WNS-I细胞融合细胞腹水为阴性对照， 多克隆抗体的效价为WP/N值>2.1最大稀释度。包被天然牛乳PLGlOOng/孔，4°C包 被过夜，洗板，加封闭液200yL37°C封闭2小时，洗涂3次。分别W纯化后的抗0LG多 抗为一抗，W免疫前新西兰大白兔血清作阴性对照，将多克隆抗体对倍稀释(从1:1000稀 释到1 :102400)加入IOOiiL/孔，37°C培育比，洗板，加入稀释的羊抗兔IgG-HRP为二抗 100^17孔，37°(：培育45111111，洗板；加11837°(：避光显色1〇111111;显色后加入浓度为12.5%硫 酸50yL/孔终止反应，在波长450nm处测定吸光值（OD值)。抗体的稀释度即为抗体的效 价。
[0018] 2不同抑下0LG热处理后与EGCG相互结合对蛋白免疫反应性的影响 2.1实验方法 2. 1. 1 0LG-EGCG常溫产物的制备及0LG热处理后与EGCG结合 通常情况下，牛乳中的PLG是W非共价键连接成二聚体，并通过氨键使运种结构达到 稳定。不同抑值下其存在形式不同，在抑为6~6.8时，其是W二聚体的形式存在，pH高 于7. 5,二聚体解离且构象发生变化形成膨胀的单体，当抑低于3. 5时，二聚体解离成单体， 抑为3. 5~5.2时，二聚体四聚化成八聚体。
[0019] 故为研究不同pH值影响下0LG-EGCG的免疫反应性，将四个不同构象下pH范围 的中间值作为本研究的抑值，即抑值为2、4. 5、6. 4、10。
[0020] 分别用抑为2、4. 5、6. 4、10的PBS为溶剂，将PLG稀释为1%，与摩尔比为1 :50 的EGCG在25°C水浴Ih;W不加EGCG的0LG为空白对照；在4°C下用SkDa半透膜对反应 后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
[0021] 分别用抑为2、4. 5、6. 4、10的PBS为溶剂，将0LG稀释为1%，在120°C油浴lOmin， 与摩尔比为1 :50的EGCG在25°C水浴Ih 不加EGCG的PLG为空白对照；在4°C下用5kDa 半透膜对反应后样品进行透析过夜，除去没有结合的EGCG。
[0022] 2.1.2免疫反应性检测 用竞争法化ISA检测不同抑下的PLG和PLG-EGCG与兔抗多克隆抗体（IgG)结合的免 疫反应性。用碳酸盐缓冲抗原（蛋白质）稀释到1yg/mL。加入100y1抗原至化ISA板上 的每个孔。在4"C下解化过夜。通过快速去掉盘中的液体来去除未结合的抗原，将离子水加 入孔中，，再次用离子水填充，洗去，重复两次，洗缓冲区。添加200 阻断缓冲区。在室溫 下解化（RT) 2小时。去除阻塞缓冲液，用缓冲水洗板S次。分别添加IOOrt(1:1000, 1:4000、 1:16000 1:64000,稀释在阻止缓冲区）样本，控制（pre-immune血清1:1000) 50Jil至孔 中，在RT解化30-60分钟。洗板S次洗缓冲区。增加IOOWHRP-I油eled羊抗兔免疫球 蛋白g(l:5000,稀释在阻止缓冲区）和解化为30分钟37"C。用PBST洗缓冲区S次。将IOOrtTMB添加到每个孔，在黑暗中解化60分钟。显色后加入浓度为12. 5%的硫酸50yL 每孔终止反应，在波长450nm处测定吸光值（OD)，用化ISA仪器读数，计算抑制率。
[0023] 抑制率=(OD未抑制一OD抑制）/ (OD未抑制一0抓Uffer)X100% 2. 1. 3圆二色光谱 参考文献的方法进行圆二色光谱的测定，分别将PBS调pH为2、4. 5、6. 4、10,将相应pH的样品稀释为蛋白浓度为1. 5X106HiolL1的溶液，在25°C下远紫外区（190-250皿)处测定 其圆二色光谱。每个样品重复扫描=次，获得累计的色谱图。图谱经过仪器溶液空白差减 和本底消除，数据通过在线服务器DICHROW邸分析，使用Selcon3算法计算蛋白质的a螺 旋、P折叠、P转角和无规则卷曲等二级结构的百分比含量。
[0024] 3结果分析 3. 1多克隆抗体的效价测定结果及分析 多克隆抗体的效价测定 通过间接化ISA法检测所获得的多克隆抗体的效价，结果见图1。
[00巧]
阴性血清：1 :1000兔1&兔2 <0. 2,阴性值低于0. 2,说明整个数据具有参考性。OD值 大于1. 0,同时效价值高于阴性值的=倍W上为合格。
[0026] 抗体稀释兔1&兔2〉1 :64000,结果表明，二者多克隆抗体的效价在1 :64000。
[0027] 棋盘法结果 表1棋盘法测试结果
取吸光值为1左右的抗原和抗体浓度比例作为最佳反应浓度，即抗原包被浓度为 0. 313yg血1，抗血清稀释倍数为1 :32000。
[0028] 3. 2免疫反应性检测结果分析 如图2-5所示，整体而言，当0LG与EGCG结合后，与IgG的结合活力均明显下降，其免 疫反应性均降低，且经过120°C高溫加热处理后的0LG再与EGCG反应结合后的产物比没有 经过预热处理的0LG和EGCG的结合产物大大降低其免疫反应性。0LG和EGCG结合产物 与IgG结合活力比纯蛋白低。
[0029] EGCG与预热处理的PLG相互结合的结合常数
根据PLG与EGCG的热力学分析，EGCG与eLG的结合主要疏水作用。高溫作用下蛋 白的结构趋于松散，所W使得内部的疏水集团外露，可能增强了蛋白与EGCG的疏水作用， 从而使蛋白与EGCG的结合能力提高。
[0030] 0LG经120°C高溫处理后，蛋白聚集发生的同时发生了蛋白构想被