一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然产物提取分离技术领域，尤其涉及一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。
【背景技术】
[0002]灵芝是一种珍贵的药用真菌，具有滋补强身、扶正固本的功效，黑灵芝是灵芝属中的一个重要品种。大量研究表明多糖是灵芝的主要功能成分之一，黑灵芝多糖已被证实具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、保护心脏和抗糖尿病等生物活性，因此，在医药保健品等领域被认为具有广阔的开发前景。
[0003]多糖的分离纯化方法有多种，其中，氧化法和阴离子交换色谱法常用于多糖的脱色和初步分离；而精细分离常用的方法是凝胶柱层析法，该法按分子质量大小对多糖成分进行分级，可以得到分子质量分布较窄的多糖级分。灵芝多糖提取物成分复杂，除活性多糖夕卜，还含有蛋白质和多酚类等杂质，给灵芝活性多糖的分离纯化带来很大麻烦。目前，灵芝多糖的分离纯化通常结合两到三种方法，这样可以得到纯度高、分布窄的多糖级分。如方积年“一种灵芝多糖及制备方法和应用”(专利号:CN1537867 A)，该专利采用梯度洗脱阴离子交换色谱与凝胶柱层析联用法，获得了高纯度的活性多糖组分，该方法已广泛应用于赤灵芝多糖的分离纯化。
[0004]Q-Sepharose Fast Flow是一种强阴离子交换树脂，根据分离物质所带电荷的多少来进行分级，能在较宽pH范围内对生物大分子进行有效分离；该树脂具有高通量、快速高效等特点，在多糖纯化领域主要应用于中性多糖和酸性多糖的分离，可实现大规模的制备。常见的梯度洗脱阴离子交换色谱可以在较短时间内对多糖进行初步分离，但很难制备性质均一的多糖组分；而凝胶柱层析法由于耗时长、稳定性差等问题，制约了灵芝多糖的分离效率，无法大量制备具有生物活性的多糖组分。本发明采用Q-Sepharose Fast Flow作为分离介质，通过不同浓度盐溶液作为洗脱液进行分段洗脱，试图提供一种高效分离制备黑灵芝免疫活性多糖的方法，该方法可提高多糖纯度和富集免疫活性多糖组分的作用，操作简单、重现性好、效率高，克服了凝胶柱等分离技术效率低、耗时长、分离不彻底等的不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种高效分离黑灵芝免疫活性多糖的方法。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的。
[0007]本发明由黑灵芝精制多糖制备免疫活性多糖的方法的具体步骤如下:
[0008](1)粗多糖制备:黑灵芝子实体粉末经95%的食用乙醇浸泡24h后，过滤、干燥，将滤渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1:40的比例混合，于90°C下搅拌浸提2h。提取液经过滤除杂后，真空浓缩至原体积的1/5，缓慢向浓缩液中加入无水乙醇，并不断搅拌，至乙醇终浓度为80%，置于4°C冰箱中醇沉过夜，离心，得到沉淀物，冷冻干燥即得黑灵芝粗多糖。
[0009](2)精制多糖制备:将步骤(1)制备的粗多糖溶于蒸馏水中，配成浓度为20mg/mL的溶液，将Sevage试剂(氯仿与正丁醇按照体积为4:1的比例混合)按多糖溶液的1/3体积加入，混合、剧烈振摇搅拌后，以4500rpm的转速离心lOmin，除去蛋白层，多糖溶液继续用Sevage试剂处理，如此重复3?5次至无游离蛋白析出为止；多糖层经透析、浓缩后，采用80%乙醇醇沉，沉淀经无水乙醇、丙酮和乙醚分别洗涤后，冷冻干燥得精制多糖PSG。
[0010](3)多糖的分离纯化:将步骤(2)中的精制多糖PSG溶于蒸馏水中，配成3?5mg/mL的溶液，离心(5000rpm的转速离心lOmin)，除去不溶物；将20?30mL多糖溶液加入阴离子交换柱(色谱柱规格为1.5x10cm)中，使样品与树脂充分交换lOmin ;第一阶段用纯水洗脱未被吸附的样品，吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1，0.2，0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同组分，对水透析脱盐、浓缩、冷冻干燥，得5个不同级分(图1)，分别记为!^，匕1，匕2，匕5和？2。
[0011](4)通过对不同组分的中性糖、糖醛酸、蛋白质和酚类物质的含量测定，结果显示匕.2为主要的酸性多糖组分，糖含量高于85%，HPLC检测显示其为单一对称峰，由此表明Fa2是一种高纯度的多糖组分，分子质量测定为12.73KDa ;通过高效阴离子交换色谱HPAEC-PAD分析Fa2组分的糖组成，显示其主要由葡萄糖(81.5% )和葡萄糖醛酸(15.6% )组成，含有少量半乳糖和甘露糖(图2);甲基化结合GC-MS和NMR波谱分析其糖连接方式，结果表明Fa2是一种酸性的β - (1 — 3，1 — 6)-葡聚糖类多聚糖；细胞活性试验筛选表明^2的体外免疫活性优于精制多糖PSG和其他组分。细胞活性试验筛选方法为:采用小鼠巨噬细胞RAW 264.7作为靶细胞，通过测定不同多糖组分刺激细胞释放NO的能力来快速筛选具有体外免疫活性的多糖组分。
[0012]本发明的积极效果如下:
[0013]1、高通量分离纯化介质Q-Sepharose Fast Flow能有效地将PSG中含有不同化学成分的组分分离；
[0014]2、有效富集了具有免疫活性的酸性多糖组分，该组分糖含量高、均一性好、免疫活性优于精制多糖PSG ;
[0015]3、本发明简化了黑灵芝多糖分离纯化的流程，显著缩短了纯化时间，提高了纯化效率，可应用于样品的大规模制备。
【附图说明】
[0016]图1黑灵芝精制多糖PSG的分离纯化流程。
[0017]图2黑灵芝免疫活性多糖Fa2的单糖组成结果。
【具体实施方式】
[0018]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0019]黑灵芝多糖采用如下方案进行提取与精制:
[0020]称取黑灵芝子实体粉末500g，置于玻璃搅拌缸中，向其中加入10L 95%的食用乙醇，室温下搅拌浸泡24h。滤渣过滤、干燥，转入提取罐中，向其中加入20L蒸馏水，于90°C下搅拌浸提2h，冷却后，提取液经过滤除杂后，真空浓缩至4L ;将浓缩液转入醇沉罐中，缓慢向浓缩液中加入16L的无水乙醇并不断搅拌，而后控制温度在4°C左右醇沉过夜，4500rpm转速离心，沉淀物冻干，即黑灵芝粗多糖，得率为7.1 %。
[0021]称取黑灵芝粗多糖1.0g，溶于300mL蒸馏水中，待完全溶解后，转入1L分液漏斗中，加入100mL的Sevage试剂(氯仿与正丁醇以4:1 (v/v)比例混合)，剧烈振摇lOmin后，以4500rpm的转速离心lOmin，除去蛋白层，多糖溶液层继续用Sevage试剂处理，重复5次至无游离蛋白析出为止；多糖层用截流分子量8000Da的透析袋对水透析3d，浓缩，加入4倍体积的无水乙醇进行醇沉，沉淀经无水乙醇、丙酮和无水乙醚分别洗涤两次后，冷冻干燥得精制多糖PSG，样品回收率为35.0%。
[0022]黑灵芝多糖采用如下实施例进行分离纯化:
[0023]实施例1。
[0024]称取精制多糖PSG样品60mg，溶于蒸馈水中，配制成浓度为3.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心lOmin)除去不溶物；将离心上清液20mL缓慢转入Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.5x10cm)中，自然渗降，使样品与树脂充分交换lOmin ;待柱平面液体几乎渗降完时，向其中缓慢加入超纯水，用约5倍柱体积的超纯水洗脱未被吸附的样品，收集洗脱液；吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1，0.2，0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同阶段的级分；5个不同级分的洗脱液经浓缩后对水透析脱盐、冷冻干燥，得分离纯化样品，分别记为 Fw, F0.!, F0.2，F0.5和 F 2，样品回收率分别为:7.9 %，22.5 %，16.3 %，25.8 % 和 15.0 %，在该分离条件下纯化60mg样品的时间为lh。
[0025]实施例2。
[0026]称取精制多糖PSG样品100mg，溶于蒸馏水中，配制成浓度为5.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心lOmin)除去不溶物；将离心上清液20mL缓慢转入Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.5x10cm)中，自然渗降，使样品与树脂充分交换lOmin ;待柱平面液体几乎渗降完时，向其中缓慢加入超纯水，用约5倍柱体积的超纯水洗脱未被吸附的样品，收集洗脱液；吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1，0.2，0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同阶段的级分；5个不同级分的洗脱液经浓缩后对水透析脱盐、冷冻干燥，得分离纯化样品，分别记为 Fw, F0.!, F0.2，F0.5和 F 2，样品回收率分别为:8.4 %，23.1 %，14.0 %，26.5 % 和 15.4 %，在该分离条件下纯化100mg样品的时间为lh。
[0027]实施例3。
[0028]称取精制多糖PSG样品150mg，溶于蒸馏水中，配制成浓度为5.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心lOmin)除去不溶物；将离心上清液30mL缓慢转入Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(1.5x10cm)中，自然渗降，使样品与树脂充分交换lOmin ;待柱平面液体几乎渗降完时，向其中缓慢加入超纯水，用约5倍柱体积的超纯水洗脱未被吸附的样品，收集洗脱液；吸附在树脂上的样品再依次用5倍柱体积的0.1，0.2，0.5和2M的NaCl溶液分段洗脱，流速均控制在10mL/min左右，分别收集不同阶段的级分；5个不同级分的洗脱液经浓缩后对水透析脱盐、冷冻干燥，得分离纯化样品，分别记为 Fw，Fai，FQ.2，FajPF2，样品回收率分别为:8.1%,22.8%,15.2%,25.3%和 16.1%，在该分离条件下纯化150mg样品的时间为lh。
[0029]实施例4。
[0030]采用Superdex_200prep grade凝胶柱(26x60cm)对PSG进行分级。称取精制多糖样品lOOmg溶于蒸馏水中，配制成浓度为5.0mg/mL的溶液，进样前样品溶液进行离心(5000rpm的转速离心lOmin)除去不溶物。上样体积为2.0mL，超纯水作为洗脱液，流速为1.0mL/min，部分收集器收集，每管收集5mL，紫外检测器(280nm)和示差折光检测器(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况，苯酚-硫酸法跟踪检测每管的糖含量。根据洗脱曲线，合并同一级分的洗脱液，分别透析、浓缩、冻干，得均一多糖组分PSG-1和PSG-2，样品回收率分别为10.3%和4.8%，在该分离条件下纯化lOOmg样品至少需要48h。
[0031]下面结合上述具体实施例中所得样品，对本发明所述的黑灵芝多糖免疫功能活性、基本理化性质和结构特征作进一步说明。
[0032]1。材料与方法
[0033]单糖标准品:鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA);没食子酸、氢氧化钠、醋酸钠、苯酚、硫酸、咔唑、无水乙醇等。以上试剂至少为国产分析纯。
[0034]小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，DMEM培养液、RPMI 1640培养液、PBS