一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及菌种发酵培养和灭活领域，更具体地说设及一种副猪嗜血杆菌的培养 方法及其灭活方法。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌是己氏杆菌科的一种短小革兰阴性杆菌，主要引起的猪多发性浆膜 炎、关节炎和脑膜炎的传染病，主要感染断奶前后仔猪。近年来，由该菌直接感染或混合感 染给养猪业带来一定的经济损失已成为猪的主要病原之一。
[0003] 副猪嗜血杆菌在培养基上生长缓慢，对营养条件要求高，在进行副猪嗜血杆菌病 灭活疫苗的制备时，副猪嗜血杆菌培养的活菌浓度直接影响疫苗的质量，同时良好的灭活 条件对疫苗的产业化也有一定的影响。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种副猪嗜血杆菌的培养方法及其灭活方法，使其副猪嗜血杆菌各 菌株获得最适宜培养和灭活条件，W便制定疫苗的产业化生产工艺。 阳〇化]为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0006] 一种副猪嗜血杆菌的培养方法，包括W下步骤：（1) 一级种子液的制备；（2)二级 种子液的制备；（3)微生物发酵罐扩大培养；其特征在于，所述的扩大培养中副猪嗜血杆菌 二级种子液接入量为2 % (V/V)。
[0007] 进一步地，所述的副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZOl株和JX03 株。
[000引进一步地，所述的扩大培养所用培养基为含5%新生牛血清和12yg/血的NAD的TSB培养基。
[0009] 进一步地，所述的扩大培养条件为揽拌速度为100~150转/分，培养溫度37°C， 培养时间8~10小时。
[0010] 进一步地，所述的副猪嗜血杆菌各菌株活菌数均> 7.OXl〇9CFU/mL。
[0011] 进一步地，所述的灭活方法为加入菌液总量0. 4%的甲醒，37°C灭活24小时。
[0012] 有益效果：本发明的培养方法获得各菌株活菌数高且稳定，同时培养成本低，灭活 时间为2地，大大的缩减了生产周期，对疫苗的产业化生产工艺有很大的提高和改善。
【具体实施方式】
[0013] 下面详细说明本发明的具体实施，有必要在此指出的是，W下实施只是用于本发 明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术熟练人员根据上述本
【发明内容】
对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍然属于本发明的保护范围。
[0014] 菌种：副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、5型HN02株、12型GZOl株、13型JX03株， 由山东华宏生物工程有限公司提供。
[0015] 培养基和试剂：含10%血清的TSA培养基和TSB培养基、甲醒溶液，由山东华宏生 物工程有限公司研发部实验室配制。
[0016] 发酵罐：由山东华宏生物工程有限公司提供。
[0017] 试验动物：3~5周龄健康易感猪，由山东华宏生物工程有限公司试验定点猪场提 供；经间接血凝试验，其副猪嗜血杆菌间接血凝抗体效价《1:4。
[001引实施例1副猪嗜血杆菌生产用种子制备
[0019] 取副猪嗜血杆菌SD02株、HN02株、GZOl株和JX03株冻干菌种分别用含NAD和新 生牛血清的TSB培养基溶解后，划线接种于含NAD和新生牛血清的TSA平皿上，置37°C培养 24小时，挑选5个典型菌落，接种含NAD和新生牛血清的TSA固体培养基，37°C培养24小 时，作为一级种子。用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子菌落，接种于含5%新生牛 血清和12yg/mLNAD的TSB培养基，置37°C振荡培养8~10小时，取样经纯检合格后作为 二级种子。
[0020] 实施例2二级种子接种量的确定试验
[0021] 种子接种量是指接入的种子体积和培养基体积的比例。
[0022] 制苗用培养基为含5%的新生牛血清和12yg/mLNAD的TSB培养基。
[0023] ^1%、2%、4%和5%(￥/￥)的比例分别接种5002株、歴02株、6201株、恥03株 的二级种子，37°C培养，静止培养2小时后，设定揽拌速度为100转/分，培养12小时，每隔 2小时取样，进行活菌计数，测定不同接种量不同培养时间菌液中的活菌数，确定二级种子 的最佳接种剂量。
[0024] 将副猪嗜血杆菌各菌株二级种子W不同接种量接入发酵罐中培养不同时间后分 别取样进行活菌计数，计数结果见表1~表4。
[00巧]表1副猪嗜血杆菌SD02株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果
[0027] 表2副猪嗜血杆菌HN02株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果
[0029] 表3副猪嗜血杆菌GZOl株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果
[0030]
[0031]表4副猪嗜血杆菌JX03株不同接种量、不同培养时间的活菌计数结果
[0033] 由表1~表4可知，随着二级种子接种量的增大，达到细菌生长稳定期的菌数所用 时间越短。根据活菌计数结果，考虑到生产成本，确定副猪嗜血杆菌各菌株二级种子的接种 量为2% (V/V)，培养时间为8~10小时。
[0034] 实施例3血清和NAD添加量的确定试验
[0035] 制苗用培养基为含NAD和血清的TSB培养基。按含12yg/mLNAD的TSB培养基 总量的5%、10%和15%的比例来添加血清，或按含5%血清的TSB培养基中NAD浓度分别 为 12yg/mLNAD、16yg/mLNAD、20yg/mLNAD的量分别接种 2% 的SD02 株、HN02 株、GZOl 株、JX03株的二级种子，37°C培养，静止培养2小时后，设定揽拌速度为100转/分，培养12 小时，每隔2小时取样，进行活菌计数，测定含不同含量的血清和含不同浓度NAD的TSB培 养基在不同培养时间菌液中的活菌数，确定在TSB培养基中血清和NAD的最佳添加量。
[0036] ①不同血清添加量对副猪嗜血杆菌各菌株培养浓度影响的结果
[0037] 制苗用培养基为含NAD和血清的TSB培养基。按含12yg/mLNAD的TSB培养基总 量的5%、10%和15%的比例来添加血清，分别接种2%含量的SD02株、HN02株、GZOl株、 JX03株的二级种子，37°C培养，设定揽拌速度为100转/分，培养12小时，每隔2小时取样， 进行活菌计数，测定含不同血清含量的TSB培养基在不同培养时间菌液中的活菌浓度，试 验结果见表5~表8。
[0038] 表5副猪嗜血杆菌SD02株在不同血清添加量下培养的活菌浓度
[0040]表6副猪嗜血杆菌HN02株在不同血清添加量下培养的活菌浓度 [0041 ]
[0042]表7副猪嗜血杆菌GZOl株在不同血清添加量下培养的活菌浓度
[0044]表8副猪嗜血杆菌JX03株在不同血清添加量下培养的活菌浓度
[0046] 由表5~表8试验结果可知，分别接种2%的副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液， 37°C培养12小时后，在含NAD的培养基中不同血清浓度的培养基中活菌计数结果也不同， 为保证各菌株的活菌数及