一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种长期体外培养和扩增肝细胞的方法，该方法在体外将成熟肝实质细胞诱导成为具有无限增殖能力的肝细胞，所述的肝细胞可用于化合物和药物的毒理学和药理学评价、肝炎病毒的研究和诊疗、肝细胞移植治疗、生物人工肝的制备等应用。
【背景技术】
[0002]一、肝脏与肝细胞
[0003]肝脏是动物体内以代谢功能为主的重要生命器官，调控着多种生理功能，主要包括解毒，储存肝糖原，合成分泌性蛋白质以及生成胆汁等。肝脏本身具有强大的再生能力，正常肝脏经三分之二部分肝切除后，残留的成熟肝细胞可快速增殖，并完全取代和恢复缺失肝脏的体积和功能。但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝硬化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能不断下降，最终危害人们的健康和生命。
[0004]全世界受肝病影响的患者超过5亿，一旦发展为终末期肝病或急性肝衰竭，目前唯一有效的治疗手段是进行肝脏移植。但是由于肝脏供体持续紧缺以及术后免疫系统对异体器官的排斥，移植手术的发展受到了严重的制约。最近基于肝细胞治疗的技术受到了广泛的关注，其中包括肝细胞移植，肝脏组织的体外重建和生物人工肝等，被认为是全器官移植较理想的替代方式。然而，由于成熟肝细胞无法长期体外培养和扩增，该方法仍旧依赖于捐献的供体肝脏，并且不能改变移植后的免疫排斥。此外，体外培养的肝细胞还是非常好的药物肝脏代谢模型以及肝炎病毒研究模型，被广大制药公司和研究机构大量使用。因此如何获得稳定而大量的肝细胞来源，成为目前最迫切的需要。
[0005]在过去的数十年中，研究者进行了各种各样的尝试，期望在体外重现肝细胞特有的强大增殖潜能。然而迄今为止，尚无报道可在体外长期培养和扩增各种动物的正常肝实质细胞。为了克服原代肝细胞在体外的生长限制，研究者通过导入SV40病毒蛋白(大T抗原或小T抗原)实现了正常肝细胞的永生化(如Fa2N-4细胞系)。此外一些来自于肿瘤的细胞系被建立起来，并表现出一些成熟肝细胞的形态和功能(如IfepaRG细胞系)。虽然这些细胞可在体外无限培养和扩增，但出于安全性的考虑以及肝细胞功能上的异常(包括P450活性的异质性)，它们的实际应用受到极大限制，通常仅作为药物代谢和毒性筛查模型，在一些制药公司被少量使用(Vallier L.,Heps with Pep:Direct Reprogramming intoHuman Hepatocytes, Cell Stem Cell, 14, March 6,2014,267-269)。
[0006]近来，利用干细胞或其他细胞来分化获得肝细胞被认为是未来肝细胞的重要来源。可诱导多能干细胞(iPS)和谱系重编程技术的诞生更是使得建立个体化肝细胞，并最终实现个性化医学变得可能。目前已有多个报道可成功地将哺乳动物的胚胎干细胞(ES)和iPS细胞定向分化成具有肝脏功能的细胞。此外，研究者还成功地将体细胞通过谱系重编程直接转分化为肝细胞，并证明这些细胞可在肝脏中增殖及重建肝脏功能。但是，无论由ES细胞，iPS细胞还是谱系重编程分化获得肝细胞，都不可能达到百分之百的效率，残存的干细胞注射入动物体内后可能形成畸胎瘤和腺瘤，因此严重影响了这些细胞的应用。此外，ES细胞取材困难且受到伦理学上的严格限制，而iPS细胞和谱系重编程均涉及多个外源基因导入，其安全性和肝细胞功能与上述永生化的肝细胞相似，因此它们的实际应用也有较大限制。
[0007]因此，最理想的肝细胞来源还是原代肝细胞，如果能实现原代肝细胞的长期体外培养和扩增，并保持正常肝细胞遗传学和功能的稳定性，将极大推动人类对肝脏的认识和肝病的诊疗。
[0008]二、肝细胞特征
[0009]肝细胞可以根据许多表型标准进行表征，包括所表达的细胞标记，酶活性，形态特征和细胞间信号特性的检测或定量。
[0010]成熟肝细胞的形态特征为其具有原代肝细胞的形态特征。该特征包括任何或所有下列各项:多边形细胞形状，双核表型，用于合成分泌蛋白的粗面内质网，用于细胞内蛋白分选的高尔基体、内质网和溶酶体复合体，过氧化物酶体和糖原颗粒，相对丰富的线粒体，并且形成细胞间的微胆管空间。
[0011]成熟肝细胞也可以根据其是否表达肝系特征性标志物来鉴定，包括白蛋白，唾液酸糖蛋白受体，α?-抗胰蛋白酶，α-胎蛋白，载脂蛋白Ε，精氨酸酶I，载脂蛋白Al，apoAI I，载脂蛋白B，apoCI 11，apoCI I，醛缩酶B，醇脱氢酶I，过氧化氢酶，CYP3A4，葡萄糖激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胰岛素生长因子I和2，IGF-1受体，胰岛素受体，瘦素，肝特异性有机阴离子转运体(LST-1)，L-型脂肪酸结合蛋白，苯丙氨酸羟化酶，转铁蛋白，视黄醇结合蛋白，促红细胞生成素(EPO)。成熟肝细胞标记物包括但不限于，白蛋白，a 1-抗胰蛋白酶，唾液酸糖蛋白受体，细胞角蛋白8(CK8)，细胞角蛋白18(CK18)，CYP3A4，富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)，葡萄糖-6-磷酸酶，酪氨酸氨基转移酶，磷酸烯醇丙酮酸烯醇和色氨酸2，3-双加氧酶。
[0012]可以使用任何合适的免疫学技术,如采用流式细胞术分析细胞表面标记,采用免疫组织化学检测细胞表面或细胞内的肝细胞标志物，采用Western印迹分析细胞裂解液中标志物的表达水平，采用酶联免疫分析，对细胞裂解液或分泌到培养基中产物进行检测。也可以通过Northern印迹分析,斑点印迹杂交分析,或实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)等方法检测肝细胞特异性标志物mRNA水平的表达情况(美国专利号US5843780)。还可以根据细胞是否显示酶活性鉴定其肝细胞特性。例如，测定对葡萄糖-6-磷酸酶活性，测定碱性憐酸酶(ALP)和 5’-核苷酸酶活性等(Maurel P., Hepatocytes-Methods and Protocols,METHODS IN MOLECULAR B1LOGY, ISSN 1064-3745)。
[0013]成熟肝细胞还可通过检测解毒活性确定其功能。细胞色素P450是单加氧酶系统的关键催化组分。该家族负责外来物质(如服用的药物)和许多内源性化合物的氧化代谢。不同的细胞色素存在特性和重叠的底物特异性。大部分的生物转化能力是由CYP1A2，2A6，2B6, 3A4，2C 9_11，2D6和2E1等细胞色素实现的。可通过检测细胞色素P450酶的活性反映细胞解毒功能。检测CYP3A4的解毒活性可使用P450-Glo?CYP3A4 DMSO耐受试验(荧光素-PPXE)和 P450-Glo?CYP3A4 cell-based/b1chemical 法(荧光素-PFBE) (Promega公司LNC，#V8911和V8901#)，还可采用CYP3A4酶的荧光底物DBOMF进行流式细胞术检测。检测CYPlAl和/或CYPlBl的解毒活性可使用P450-Glo?检测(荧光素-CEE) (Promega公司#V8762)。检测CYP1A2和/或CYP4A解毒活性使用的是P450-Glo?检测(荧光素-ME)(Promega公司公司#V8772)。检测CYP2C9解毒活性可使用P450_Glo?CYP2C9法(荧光素-H) (Promega 公司，評8791)。
[0014]成熟肝细胞还可通过生物功能分析如糖原储存、尿素产生、胆汁分泌以及脂质合成来进行评估。糖原贮积通过碘酸雪夫(PAS)染色进行测定，阳性为特征性的红色糖原颗粒。尿素产量可通过试剂盒进行测定。胆汁的分泌可以通过荧光素二乙酸酯时间的推移试验来测定。简言之，将贴壁培养的肝细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次，加入含有荧光素二乙酸酯(20微克/毫升)(Sigma-Aldrich公司)的无血清培养基,37°C孵育35分钟，随后用PBS洗涤3次和荧光成像。脂质合成(中性甘油三酯)可通过油红O或BODIY染色进行检测。
[0015]成熟肝细胞还可通过其对环境病原微生物的易感性来评价。其中包括肝炎病毒A，B，C和delta型，Epstein-Barr病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，肺结核和疟疾。例如，乙型肝炎易感性可以用HBV携带者的血清感染肝细胞，随后通过免疫组织化学或RT-PCR检测病毒核心抗原(HBcAg)。
[0016]三、肝细胞的应用
[0017]肝细胞具有多种应用，包括筛选细胞毒性化合物和药物化合物等；在体外研究肝脏疾病和病毒感染的机制，如HBV和HCV的感染机制及抗病毒治疗；研究药物和/或生长因子的作用机制；生物人工肝；体内肝细胞移植治疗等，以下仅例举几例:
[0018]1、化合物筛查
[0019]培养和扩增的肝细胞可用于标准药物筛选和毒性测定，这些检测之前通常在只能短期培养的原代肝细胞中进行。候选药物化合物活性的评估通常包括候选化合物处理所述的细胞后，细胞的形态，表型或代谢活性发生的改变(与未处理的细胞或对照处理的细胞)，然后关联该化合物的作用与观察到的变化。化合物可具有对肝细胞的药理学作用，或对肝脏有副作用。两种或多种药物可以组合进行测试，以检测可能的药物-药物相互作用。此外，如果肝细胞可长期培养并维持成熟肝细胞状态，其还可用于在体外评估化合物的长期效应和毒性。
[0020]肝毒性的检测可通过对细胞活力，存活，形态和酶泄漏进入培养基的量来测定。还可检测化合物是否影响肝细胞功能(例如，糖异生，尿素合成，以及血浆蛋白的合成等)。乳酸脱氢酶(LDH)是一个较好的标记，因为肝同工酶(V型)培养上清中较为稳定，可在培养12-24小时后进行检测。其它酶，如线粒体谷氨酸草酰乙酸转氨酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶的泄漏也可用于检测。此外，肝毒性还可通过测定白蛋白，胆固醇和脂蛋白的合成和分泌；结合胆汁酸和胆红素运输；尿素生成；细胞色素P450的水平和活动；谷胱甘肽水平；a -谷胱甘肽-S-转移酶的释放；ATP，ADP和AMP的代谢；细胞内K+和Ca2+浓度；核基质蛋白或寡聚核小体的释放；诱导细胞凋亡(由细胞变圆，染色质浓缩和核碎裂表示)等来进行评估。化合物对DNA合成或结构的影响可通过测量[3H]-胸苷或BrdU掺入以及DNA修复来评价。
[0021]2、肝细胞移植治疗
[0022]培养和扩增的肝细胞可用于急慢性及遗传性肝病的治疗，以部分恢复病人的肝功能。目前常用三种动物模型来验证体外培养的肝细胞是否具有体内功能。
[0023]FAH小鼠肝损伤模型:延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因剔除小鼠，简称Fah z小鼠,是Grompe等建立的遗传型酪氨酸血症I型小鼠模型。该模型小鼠由于Fah基因的缺失，酪氨酸分解代谢受阻，无法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸盐，导致酪氨酸在体内蓄积