一种nk细胞的诱导培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体的说是设及一种NK细胞的诱导培养方法。
【背景技术】 阳002]自然杀伤细胞（naturalkillercell,NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿 瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发 生。
[0003] 细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的有一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放 化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的癌细胞。细胞治疗主要包括NK 细胞治疗、CTL细胞治疗、CIK细胞治疗W及LAK细胞治疗等。
[0004] NK细胞是机体重要的免疫细胞，不只消灭细菌和病毒感染，还能消灭癌细胞或肿 瘤。因此NK细胞被广泛应用于肿瘤癌症的临床治疗。目前，NK细胞的体外扩增培养多为 二维培养，即把NK细胞接种到培养瓶中，添加诸如X-VIVO15免疫细胞培养基W及加入一 些因子组合诱导NK细胞扩增培养。然而，临床上采用NK细胞治疗肿瘤时，需要NK细胞的 量较高，而普通的NK细胞诱导培养方法扩增的数量有限，很难达到临床回输的要求；同时 所诱导培养的NK细胞中表面抗原表达水平（CD3-、CD56+)比较低，细胞对癌细胞的毒性效 果不高。因此，必需寻找用另一种能增强NK细胞的增殖活性，最好同时能增强NK细胞的杀 伤能力的免疫细胞培养方法。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种NK细胞的诱导培养方法，使得所述方法能 够显著提高NK细胞的数量。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种NK细胞的诱导培养方法，使得所述方法能够 显著提高NK细胞表面抗原CD3-/CD56+的表达水平，增强NK细胞的杀伤能力。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[000引一种NK细胞的诱导培养方法，包括：
[0009] 步骤1、制备细胞=维培养载体；
[0010] 步骤2、从外周血分离出单个核细胞并接种到步骤1中的载体中，同时补加IL-2、 比-15、比-21W及0KT-3因子诱导培养，定期补液。
[0011] 本发明主要引入了细胞S维培养的技术思维来解决现有免疫细胞NK细胞的技术 问题，=维培养是指将具有=维结构的载体与各种不同的种类的细胞在体外共同培养，使 细胞能够在载体的=维立体空间结构中迁移、生长，构成=维的细胞载体复合物。
[0012] 二维细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往 和体内情况不相符；动物实验虽在体内进行，但体内多种因素制约W及体内和外界环境相 互影响而不能观察到研究者最为关屯、的中间过程。因此，现有技术提出了=维细胞培养技 术模拟体内的微环境，填补了单层细胞培养和动物实验的鸿沟，主要用于医学领域的理论 研究，但是将其用于提高免疫细胞的增殖活性W及杀伤活性还未见报道。而本发明针对现 有NK细胞培养方式的缺点，将细胞S维培养载体引入NK细胞的培养中，利用载体进行NK 细胞的S维培养，同时配合适宜的细胞因子，由此促进NK细胞的增殖，W及提高其表面抗 原CD3-/CD56+的表达水平，增强NK细胞的杀伤能力。
[0013] 在本发明中，所述步骤1具体为：
[0014] 用免疫细胞培养基稀释细胞=维培养载体材料，于细胞培养容器中解育包被，获 得细胞=维培养载体。所述细胞=维培养载体材料是该领域经常用到的具有=维结构的载 体材料。
[0015] 其中，作为优选，所述免疫细胞培养基为X-VIVO 15培养液；所述具有S维结构的 载体材料为Matrigel基质；所述免疫细胞培养基稀释细胞S维培养载体材料的体积比为 5:1 ;所述各因子的浓度为：100~lOOOU/mL比-2、10~lOOng/mL比-15、10~lOOng/mL a-21、50~100ng/mL0KT-3。
[0016] 本发明优选地的载体材料Matrigel基质是从富含胞外基质蛋白的邸5小鼠肿瘤 中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包 含生长因子和基质金属蛋白酶等，市售可得。在室溫条件下，Matrigel聚合形成具有生物 学活性的=维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞 的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的理论研究。
[0017] 作为一个整体的优选方案，所述步骤1为： 阳0化]混匀Matrigel基质成匀浆状，用X-VIVO 15培养液按X-VIVO 15培养液：Matrigel基质=5:1的体积比稀释Matrigel基质，将稀释的Matrigel基质包被于T75培 养瓶中，室溫下解育1小时，用X-VIVO 15培养液冲洗，去除未结合的Matrigel基质，获得 细胞=维培养载体。
[0019] 同时，本发明所述外周血分离出单个核细胞可参照本领域已有的分离方法，本发 明优选为：
[0020] 外周血加生理盐水稀释，加入到淋己分离液上层，离屯、，然后用己氏吸管吸取单个 核细胞，清洗、离屯、、重悬，分离得到单个核细胞悬液。
[0021] 更进一步优选为：
[0022] 把抽取的人外周血用生理盐水对血液进行1:1稀释并混合均匀，获得血液稀释 液；
[0023] 另取离屯、管，加入淋己细胞分离液，把混匀的血液稀释液缓慢沿管壁加入淋己细 胞分离液上层，注意不要冲破分离液层（淋己细胞分离液：血液稀释液为1 :2体积比）；
[0024] 放入冷冻离屯、机中，3000巧m/min离屯、30min。 阳0巧]离屯、结束后，用己氏吸管吸取单个核细胞并用生理盐水清洗，再次离屯、，用免疫细 胞培养基（优选X-VIVO 15培养液）重悬细胞，获得单个核细胞悬液。
[00%] 作为优选，步骤2所述诱导培养为在37°C、5%二氧化碳的环境中培养14天。
[0027] 作为优选，所述单个核细胞的接种密度为1 XIO6Cel1/mL。
[0028] W本发明所述方法进行NK细胞的诱导培养，相对于现有的诱导培养方法，本发明 能够将NK细胞数量扩增到1〇9数量级，而现有技术中的NK细胞量为10S数量级，活力也高 于现有技术培养的NK细胞，而且本发明诱导培养的NK细胞中CD3-/CD56+的表达水平为 85. 6%，现有技术培养的NK细胞表达水平为74. 4%，同时对K562细胞的杀伤活性上也显著 高于现有技术培养的NK细胞。
[0029] 由W上技术方案可知，本发明在NK细胞的诱导培养引入了细胞S维培养载体进 行诱导培养，同时配合细胞因子的加入，由此解决了传统培养方法扩增的数量有限、表面抗 原CD3-/CD56+的表达水平较低、细胞杀伤活性不高的问题，满足临床上对于NK细胞的需 求。
【附图说明】
[0030] 图1所示为NK细胞的镜检图，其中A为现有对照方法诱导培养的NK细胞的镜检 图，B为本发明方法诱导培养的NK细胞镜检图；
[0031] 图2所述为NK细胞表面抗原CD3-/CD56+表达水平的流式检测图，其中A为现有 对照方法诱导培养的NK细胞表面抗原表达水平图，B为本发明方法诱导培养的NK细胞表 面抗原表达水平图；
[0032] 图3所示为现有对照方法诱导培养的NK细胞对K562杀伤活性折线图；
[0033] 图4所示为本发明方法诱导培养的NK细胞对K562杀伤活性折线图。
【具体实施方式】
[0034] 本发明实施例公开了一种NK细胞的诱导培养方法。本