脂肪酶变体的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明申请是基于申请日为2007年1月22日，申请号为200780002901.2(国际 申请号为PCT/US2007/060841)，名称为"脂肪酶变体"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及脂肪酶变体。
【背景技术】
[0003] 脂肪酶是有用的，例如，作为洗涂剂酶用于从衣物和其它纺织品去除脂质或 脂肪沾污，作为用于面包和其它烘赔产品的生面团的添加剂。因此，源自细毛嗜热霉 (ThermomycesIanuginosus)(同物异名疏棉状腐质霉（Humicolalanuginosa)，EP258 068和EP305 216)的脂肪酶W商品名Lipoiase般（NovoNordiskA/S的产品）W洗涂剂 用途出售。WO0060063描述了细毛嗜热霉脂肪酶的变体，其在洗涂剂溶液中具有特别优良 的初次洗涂性能（first-washperformance)。WO9704079、WO9707202 和WO0032758 也 公开了细毛嗜热霉脂肪酶的变体。
[0004] 在一些应用中，感兴趣的是将产生气味的短链脂肪酸的形成降至最低。因此， 已知的是含有脂肪酶的洗衣洗涂剂有时可能在W牛奶污染的织物上留下残留的气味巧P 430315)。WO02062973公开了脂肪酶变体，其中通过附接（attaching)C末端延伸减少了气 味的产生。
【发明内容】
[0005] 发明人发现，通过在脂肪酶的某些区/位置引入突变，可改进脂肪酶的性质或特 征。
[0006] 在优选实施方案中，本发明设及用于洗涂剂具有改进性能的脂肪酶。例如，本发明 通过在亲本脂肪酶中鉴定的一个或多个区中引入突变而获得的产生气味的倾向降低的变 体。在另一个优选实施方案中，本发明提供脂肪酶变体，与亲本脂肪酶相比，其产生气味的 可能降低而无C末端延伸的附接。
[0007] 在另外的方面中，本发明设及编码本发明脂肪酶变体的DNA序列，携带所述DNA序 列的表达载体和包含DNA序列或表达载体的转化宿主细胞。
[0008] 在另一个方面，本发明提供产生本发明脂肪酶变体的方法。
[0009] 具体地，本发明设及如下各项：
[0010] 1.亲本脂肪酶的变体，其中变体包含至少=个选自下组的取代（使用SEQID N0:2编号）：
[0011] a)I区中的至少两个取代，和
[0012] b)II区中的至少一个取代，和
[0013] C)III区中的至少一个取代，和
[0014]d)IV区中的至少一个取代；
[0015] 和其中所述变体具有脂肪酶活性。
[0016]2.项1的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶的I区中至少两个取代包含在对应于位置 231和233的位置的氨基酸的取代（使用SEQIDNO:2编号）。
[0017] 3.项2的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶的I区中至少两个取代包含在对应于位置 231和233的位置的用氨基酸R的取代（使用SEQIDNO:2编号）。
[001引 4.根据项1的脂肪酶变体，其变体脂肪酶与SEQIDNO:2至少80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%相同。
[0019] 5.根据项1的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶是具有SEQIDN0:2的氨基酸序列的 脂肪酶。
[0020] 6.根据项2的脂肪酶变体，其中所述脂肪酶在对应于SEQIDNO: 2的位置4和/ 或位置227的位置包含其它取代。
[002。 7.根据项6的脂肪酶变体，其中脂肪酶具有对应于X4V和X227G的取代（使用SEQ IDNO:2 编号）。
[0022] 8.根据项1的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶的II区中至少一个取代包含如下取 代，其选自由在对应于位置202、210、211、255和256的位置的取代组成的组（使用5601〇 N0:2编号）。
[0023] 9.根据项8的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶中至少一个取代选自下组：X202G、 X210K、X211L、X255Y/V和X256K(使用沈QIDN0:2 编号）。
[0024] 10.根据项1的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶的III区中至少一个取代包含如下取 代，其选自由在对应于位置83、86和90的位置的取代组成的组（使用SEQIDN0:2编号）。 [00巧]11.根据项10的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶中至少一个取代选自下组：X83T、 X86V和X90A/R(使用沈QIDN0:2 编号）。
[0026]12.根据项1的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶的IV区中至少一个取代包含如下取 代，其选自由在对应于位置27、58和60的位置的取代组成的组（使用SEQIDN0:2编号）。
[0027] 13.根据项1的脂肪酶变体，其中亲本脂肪酶的IV区中至少一个取代包含选自下 组的取代：X27R、X58N/A/G/P/T和X60S/V/G/N/R/K/A/L(使用SEQIDN0:2 编号）。
[0028] 14.根据项1的脂肪酶变体，其中脂肪酶变体还包含亲本脂肪酶中的至少一个取 代，其选自由在对应于如下位置的位置的取代组成的组：位置81、147、150、227和249 (使用 沈QIDNO:2编号）。
[0029] 15.根据项1的脂肪酶变体，其中所述脂肪酶变体还包含选自下组的至少一个取 代：X81Q/E、X147M/Y、X150G和X249R/I/U使用沈QID側:2编号）。
[0030] 16.项1的脂肪酶变体，其中所述脂肪酶包含选自下组取代的取代：
[0038]h)S58N+V60S+L147M+F211L巧231R+N233R
[0039]i)Q4V+S58A+V60S+S83T+I86V+A150G巧210K+L227G巧231R+N233R+P25服
[0040]j)S58N+V60S+I86V+A150G+L227G巧231R+N233R+P25服
[0041] 17.编码项1-16的脂肪酶变体的DNA序列。
[004引18.携带项17的DNA序列的表达载体。
[004引19.包含项17的DNA序列的转化宿主细胞。
[0044] 20.产生脂肪酶变体的方法，所述方法包含在利于产生脂肪酶变体的条件下培养 项19的转化宿主细胞，和从得到的培养液中回收脂肪酶变体。
[0045] 21.沈QIDN0:2 的变体，其包含Q4V、S58N/A/G/P/T、I90R或Q249I/L中的至少一 个突变。
[0046] 附图简述
[0047] 图1显示脂肪酶的比对。
[004引序列表
[0049]SEQIDNO: 1显示编码来自细毛嗜热霉的脂肪酶的DNA序列。
[0050]SEQIDN0:2显示来自细毛嗜热霉的脂肪酶的氨基酸序列。
[0051]SEQIDNO:3显示来自曲柄準头霉（AbsidiarefIexa)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0052]SEQIDNO:4显示来自伞状準头霉（Absidiacorymbifera)的脂肪酶的氨基酸序 列。
[005引SEQIDNO:5显示来自曼赫根毛霉（RhizmucormieheU的脂肪酶的氨基酸序列。
[0054]SEQIDN0:6显示来自米根霉她izopuscxryzae)的脂肪酶的氨基酸序列。
[005引SEQIDNO:7显示来自黑曲霉（Aspergillusniger)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0056] 沈QIDN0:8显示来自塔宾曲霉（Aspergillustubigensis)的脂肪酶的氨基酸序 列。
[0057]SEQIDN0:9显示来自尖镶抱（化sariumO巧sporum)的脂肪酶的氨基酸序列。
[005引SEQIDNO: 10显示来自异抱镶抱（Fusariumheterosporum)的脂肪酶的氨基酸序 列。
[0059]SEQIDNO: 11显示来自米曲霉（Aspergilluscxryzea)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0060]SEQIDNO: 12显示来自沙口柏干酪青霉（Peniciliumcamembertii)的脂肪酶的 氨基酸序列。
[0061] 沈QIDNO: 13显示来自臭曲霉（Aspergillusfoeti化S)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0062]SEQIDNO: 14显示来自黑曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
[0063]SEQIDNO: 15显示来自米曲霉的脂肪酶的氨基酸序列。
[0064] 沈QIDNO: 16显不来自Landerinapenisapora的脂肪酶的氨基酸序列 [00财发明详述
[0066] 亲本脂肪酶
[0067] 可W使用任何合适的亲本脂肪酶。在优选实施方案中，亲本脂肪酶可W是真菌脂 肪酶。在另一个优选实施方案中，亲本脂肪酶可W与SEQIDN0:2中所示的细毛嗜热霉的序 列具有至少 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% 的同源性，所述同源性如"同源性和比对"部分所定义。
[0068] 亲本脂肪酶可W是酵母多版，例如念珠菌属（Camiida)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)、毕赤酵母属巧ichia)、酵母属（Saccharomyces)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)或西萍著霉属（Yarrowia)多版；或更优选是丝状真菌多版， 例如枝顶抱霉属（Acremonium)、曲霉属（Aspergillus)、短梗霉属（Aureobasidium)、 隐球菌属（Cryptococcus)、Filobasidium、镶抱属（F'usarium)、腐质霉属（Humicola)、 梨抱菌属（Magnaporthe)、毛霉属（Mucor)、毁丝霉属（Myceliophthora)、新考玛脂 霉属（Neocallimastix)、脉抱菌属（Neurospora)、拟青霉属巧aeciIomyces)、青霉 属巧enicillium)、瘤胃壶菌属（Piromyces)、裂權菌属（Schizophyllum)、躁节菌 属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭抱壳属（Thielavia)、弯颈霉属 (Tolypocladium)或木霉属（Trichoderma)多版D
[0069]在优选的方面，亲本脂肪酶是卡尔酵母（Saccharomycescarlsbergensis)、酿 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母（Saccharomycesdiastaticus)、道格控 氏酵母（Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母（Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母 (Saccharomycesnorb