砂梨品种清香果皮全褐性状基因位点的分子标记及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子遗传学领域，设及一种砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的 分子标记，尤其设及该种砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 砂梨是我国重要的南方果树，属于多年生木本植物，童期较长。果皮色泽是最重要 的果皮性状之一，果皮颜色一致、无果诱是优质商品梨的重要指标。果皮褐色属于果实性 状，传统杂交育种选育方法周期长、难度大。一般需要3~5年结果后才能开展初步鉴定。 通过定位果皮褐色性状基因位点来辅助育种可W有效解决运一问题。
[0003] 遗传研究表明，梨果皮全褐性状受单个或数个主效基因位点控制，不同的材料其 控制果皮全褐性状的基因位点可能会存在差异。
[0004]'清香'是由嘴世纪'（毕）与S花梨'U)杂交选育而成，果皮褐色性状来自 花梨花梨'属我国优良的地方品种，栽培历史悠久，品质优良，是我国砂梨育种的 重要亲本之一。'清香'（毕）与'翠冠'（S)进行杂交得到杂种Fl中，果皮全褐与非全褐 单株比经卡方检测满足1:1的分离比，运表明'清香'的果皮全褐性状是单基因控制。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有的不足，公开了一种砂梨品种清香果皮全褐性状基因位点的分子 标记，还公开该种砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得W解决。
[0007] 砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种'清 香'8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp867引物，其序列为：
[0008]左端引物序列CCACCTCACCTTATCCCTCA，
[0009]右端引物序列GCGTTTGCTCCTCGTACTTC。
[0010] 扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为14化P，即为砂梨品种 '清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种'清香'8号染色体， 利用PCR对'清香'与'翠冠'杂交得到的Fl代进行检测，果皮全褐单株准确率96.3%，利 用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0. 004。
[0011] 砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种清香 8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp868引物，其序列为：
[0012]左端引物序列AAAAAGTGATGTGTGGATCGC， 阳〇1引 右端引物序列CTGGTGACTTGCAAGCTAGG。
[0014]扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为129bp，即为砂梨品种 '清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种'清香'8号染色体， 利用PCR对'清香'与'翠冠'杂交得到的Fl代进行检测，果皮全褐单株准确率97.0%，利 用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0. 003。
[0015] 砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种'清 香'8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp873引物，其序列为：
[0016]左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，
[0017]右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。
[0018] 扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为24化P，即为砂梨品种 '清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种'清香'8号染色体， 利用PCR对'清香'与'翠冠'杂交得到的Fl代进行检测，果皮全褐单株准确率97.0%，利 用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0. 003。
[0019] 砂梨品种'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，基因位点位于砂梨品种'清 香'8号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp876引物，其序列为：
[0020] 左端引物序列CGCTTTCGAACACAAAACAA，
[0021] 右端引物序列CTGGCACTTTGAATTCGCTT。
[0022] 扩增砂梨全褐果皮品种或育种材料DNA，获得的扩增片段为24化P，即为砂梨品种 '清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，该基因位点位于砂梨品种'清香'8号染色体， 利用PCR对'清香'与'翠冠'杂交得到的Fl代进行检测，果皮全褐单株准确率97.0%，利 用Excel软件测得与果皮全褐性状不相关的概率P值为0. 003。
[0023] 作为优选，基因位点为Rus. zaas-8。
[0024] W上提到的砂梨'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括W下 方法：
[00对 A.W砂梨品种澤冠'为父本与砂梨品种'清香'进行杂交，得到杂种Fl; 阳0%] B.用CTAB法提取Fl群体各单株的DNA，采用简单序列重复的标记SSR对两亲本 进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.〇8g/ml的聚丙 締酷胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物， 亲本间有多态的引物在Fl群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因 型资料；
[0027] C.根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建砂梨的遗传连锁图，；
[0028]化果实成熟期对Fl每个单株进行果实皮色鉴定，获得Fl每个单株的果实皮色性 状；
[0029]E.根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株的果实皮色性状，通 过分析与果皮全褐性状相关的概率P值确定分子标记，P<〇. 05的分子标记，即为分子标记。
[0030] 作为优选，步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
[0031] 作为优选，步骤C中，用软件Mapmaker2. 0,最小LOD值设为3,获得连锁图。
[0032] 作为优选，步骤E中，根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应每个单株 的果实皮色性状，分析测得与果皮全褐性状相关的概率P值，P<〇. 05的分子标记，即为分 子标记。果皮全褐性状基因位点的位置由分子标记的染色体位置确定：在'清香'中发现 Zaasp867(P= 0. 004)、Zaasp868(P= 0. 003)、Zaasp873(P= 0. 003)、Zaasp876(P= 0. 003) 标记与砂梨果皮全褐性状基因位点紧密连锁，Zaasp867标记、Zaasp868标记、Zaasp873标 记和Zaasp876标记即为获得的砂梨'清香'果皮全褐性状基因位点Rus.zaas-8的分子标 记。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0034] (1)本发明提供砂梨'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记，通过检测与果皮 全褐性状基因位点连锁的分子标记，可W预测砂梨果实皮色性状，加快砂梨果实皮色性状 的选择进度。
[0035] (2)通过本发明分子标记在国际上首次定位获得了砂梨品种'清香'中的果皮全 褐性状基因位点，它们可获得96. 3%~97.0%的果皮褐色检出率。砂梨为自交不亲和树 种，树体为Fl杂种，基因组高度杂合，对砂梨果皮全褐性状基因位点的精确定位工作居于 同领域前列。
[0036] (3)通过本发明分子标记定位的基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测运些与果 皮全褐性状基因位点连锁的分子标记，即可W预测砂梨植株的果皮褐色性状，用于砂梨品 种或品系的基因型检测，W判断该品种或品系是否具有果皮全褐性状，进而快速筛选目标 果实皮色品种或品系用于砂梨育种。质量性状基因位点的检测方便快速，不受环境影响。
[0037] (4)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要等到植株度过 童期，结果后才可进行果实褐皮性状调查，不仅周期很长，也占用了±地资源。因此传统育 种不仅费时，而且成本高。通过检测果皮全褐性状基因位点，可W在苗期就鉴定出全褐果皮 的单株，进行早代筛查，不仅节约生产成本而且大大提高砂梨果实皮色性状的选择效率。
【具体实施方式】 阳0測 实施例1
[0039]砂梨'清香'果皮全褐性状基因位点的分子标记的筛选方法，包括W下方法，