一种鉴定胡桃木细小蠹的引物、试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及胡桃木细小蠢鉴定领域，具体而言，设及一种鉴定胡桃木细小蠢的引 物、试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002] 目前，对胡桃木细小蠢的鉴定主要是依据W下形态特征：
[000引 （1)体形微小，身体全长1. 5-1. 9mm，约为体宽的2. 8-3. 1倍，雌虫体色黄褐，雄虫 近黑色。触角键状部第1、第2节间有嵌隔。额面轻微向口上片边缘抬起，侧缘突成半圆状， 与眼缘的距离为小眼直径的2-3倍；雌虫额面平或稍凹，表面光滑，刻点细密匀称，茸毛密 集，近边缘的茸毛较长；雄虫额面宽而下凹，刻点粗糖，茸毛短且疏，较不显眼。刚毛最长约 达一半眼距。
[0004] (2)前胸背板：长约为宽的1. 10-1. 16倍，自基部起一半侧缘横直，前缘弓成宽半 圆形。前缘有约18个银齿。背板顶部位于中部或中部偏前，前半部为鱗状瘤区，瘤多有缺 亥IJ，呈4-6排清晰的近同屯、圆状排列，背板前缘着生的鱗状瘤数目超过12,同排相邻的鱗状 瘤常在基部相连，常于背中线附近出现重叠。背板后半部分为刻点区，表面平缓而光滑，刻 点稍大且密。背板前部表被刚毛较长，随鱗状瘤整齐排列，后部刚毛较疏细。
[0005] (3)銷翅：长约为宽的1. 8-1. 9倍，约为前胸背板1. 7倍长，自基部起3/4侧缘横 直，銷翅末端纯圆。銷翅斜面较睹，刻点较大，排列成行形成刻点沟，其中第1、第2沟刻点 较浅，除第1刻点沟于斜面处下陷外，其余刻点沟不下陷。沟间部平滑，宽度约为刻点沟的 1倍或1. 5倍；第1沟间部十分宽，并明显向上隆起；第2沟间部与1等宽，平滑略呈革质； 第1、第3沟间部上各有1列极疏的刻点。位于刻点沟内短且细的刚毛延伸至翅銷基部，沟 间部刚毛大部分较疏地排列于銷翅斜面的基数刻点沟上。雄虫第1、第2沟间部各有1列小 颗粒。
[0006] 有明显的形态鉴别特征的昆虫，有经验的昆虫鉴定工作者会在最短的时间内鉴定 出结果。形态鉴定最难解决的问题是具有细微差异的近缘种或区别近似种，尤其是对于鉴 定经验不够丰富的鉴定者而言，更加困难。由于形态极相似，因而往往找不到好的形态鉴别 特征。所W需要分子学鉴定方法去进一步区分。
[0007] 目前分子学鉴定方法能够准确的区分不同目、科的物种，但对于同属的多个近缘 物种的区分仍然面临巨大的挑战。对序列高度相似的近缘物种设计只扩增一个物种的引物 是困难的；传统物种特异性PCR对假阴性、假阳性结果很敏感。
[000引有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一目的在于提供一种鉴定胡桃木细小蠢的引物，该引物特异性强，敏 感度高，重复性好，能很稳定的鉴定是否为胡桃木细小蠢。
[0010] 本发明的第二目的在于提供一种鉴定胡桃木细小蠢的试剂盒，为胡桃木细小蠢的 鉴定提供便捷。
[0011] 本发明的第=目的在于提供一种鉴定胡桃木细小蠢的方法，该方法结合形态学鉴 定和分子生物学鉴定技术，鉴定准确率高，方便快捷，为胡桃木细小蠢提供科学的分类鉴定 依据。
[0012] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[0013] 一种鉴定胡桃木细小蠢的引物，由第一引物对、第二引物对、第=引物对和第四引 物对组成；
[0014] 所述第一引物对由上游引物PI-F和下游引物PI-R组成，所述上游引物PI-F的碱 基序列如SEQIDNo. 1所示；所述下游引物Pl-R的碱基序列如SEQIDNo. 2所示；
[001引所述第二引物对由上游引物P2-F和下游引物P2-R组成，所述上游引物P2-F的碱 基序列如SEQIDNo. 3所示；所述下游引物P2-R的碱基序列如SEQIDNo. 4所示；
[0016] 所述第S引物对由上游引物P3-F和下游引物P3-R组成，所述上游引物P3-F的碱 基序列如SEQIDNo. 5所示；所述下游引物P3-R的碱基序列如SEQIDNo. 6所示；
[0017] 所述第四引物对由上游引物P4-F和下游引物P4-R组成，所述上游引物P4-F的碱 基序列如SEQIDNo. 7所示；所述下游引物P4-R的碱基序列如SEQIDNo. 8所示。
[0018] 本发明提供的鉴定胡桃木细小蠢的引物，根据生物系统生物学，结合胡桃木细小 蠢的近缘物种的已知序列，通过标准品的多次验证得到，该引物特异性强，敏感度高，重复 性好，能很稳定、快速的鉴定是否为胡桃木细小蠢。
[0019] 本发明还提供了一种鉴定胡桃木细小蠢的试剂盒，含有权利要求1中所述的第一 弓I物对、第二引物对、第S引物对化及第四引物对中的至少一个引物对。
[0020] 如：在一些实施例中，鉴定胡桃木细小蠢的试剂盒，可W含有第一引物对、第二引 物对、第=引物对W及第四引物对中的任一个；在一些实施例中，鉴定胡桃木细小蠢的试剂 盒，可W含有第一引物对、第二引物对、第=引物对W及第四引物对中的任两个；在一些实 施例中，鉴定胡桃木细小蠢的试剂盒，可W含有第一引物对、第二引物对、第=引物对W及 第四引物对中的任=个；在一些实施例中，鉴定胡桃木细小蠢的试剂盒，含有第一引物对、 第二引物对、第=引物对W及第四引物对。
[0021] 为了便于应用，优选地，所述试剂盒还含有Taq酶、dNTPs和PCRbuffer。
[0022] 本发明还提供了一种鉴定胡桃木细小蠢的方法，对待检测样品进行分子生物学鉴 定；所述分子生物学鉴定是W权利要求1中的第一引物对、第二引物对、第S引物对和第四 引物对对待检测样品的基因组提取物进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行检测即可。
[0023] 目前分子学鉴定方法能够准确的区分不同目、科的物种，但对于同属的多个近缘 物种的区分仍然面临巨大的挑战。本发明改进了传统的物种特异性PCR，设计多套中等特异 性引物，通过综合分析几个PCR的结果来确定物种的身份。由中等特异性引物建立的多个 PCR称为组合PCR。本发明建立的组合PCR方法较传统物种特异性PCR的优势在于：
[0024] (1)对序列高度相似的近缘物种设计只扩增一个物种的引物是困难的，而组合 PCR对引物特异性要求较低即允许引物扩增几个物种，因此，引物设计相对容易，运种设计 引物的理念，不仅增加了引物的选择空间降低引物设计的难度，而且可W充分利用基因不 同区域的进化差异，使分析更加客观准确。
[002引 似传统物种特异性PCR对假阴性、假阳性结果很敏感，而组合PCR中个别PCR结 果出现假阴性或假阳性结果并不会对鉴定结果有本质的影响，仍然可W根据组合PCR的结 果判断样本的疑似身份；
[0026] (3)组合PCR同时利用了多个目的片段，从多个角度反映样品身份，比传统的物种 特异性PCR准确性更高；传统PCR鉴别物种时，所需的特异性引物数量一般等于甚至大于待 区分物种的数量，而组合PCR中由于各PCR间交叉效果，其能够用相对较少的反应鉴别多个 物种。
[0027]本发明提供的一种鉴定胡桃木细小蠢的方法，W第一引物对、第二引物对、第立引 物对和第四引物作为引物，对待检测样品的基因组提取物进行PCR扩增，然后对PCR扩增产 物进行检测，方便快捷，可靠性高。
[0028]进一步地，在所述分子生物学鉴定前先对待检测样品进行形态学鉴定，确定符合 胡桃木细小蠢的形态特征后，再进行所述分子生物学鉴定。
[0029]先采用形态学方法进行初步鉴定，其优点有：
[0030] (1)误差小：形态学研究直观，中间环节少，造成人为误差的可能性最小，只要保 持昆虫标本的完整性，不同的人可进行多次重复的观察，必要时可与模式标本对比，W减少 鉴定错误；
[0031] (2)发现昆虫数量巨大，积累文献资料多：在昆虫分类研究的几百年里，已经采集 了大量的标本、命名了大量的模式种，迄今为止已描述的昆虫种类有100万种W上，同时积 累了大量的文献资料，培育了很多具有丰富昆虫鉴定经验的专家；
[0032] (3)研究方便：需要仪器较少，只需放大镜和显微镜，操作简单，对于绝大多数具 有明显的形态鉴别特征的昆虫，形态鉴定最直观、最简便；
[0033] (4)鉴定周期短：对常见和具有明显的形态鉴别特征的昆虫，有经验的昆虫鉴定 工作者会在最短的时间内鉴定出结果。
[0034]同时，本发明为了进一步确保对物种鉴定的准确性，区分形态相似的近缘物种，采 用分子生物学鉴别的方法加W辅助。
[0035]形态学鉴定采用现有的胡桃木细小蠢的形态特征进行。具体形态学鉴定特征如