一种培育植物根系发育增强并延缓叶片衰老的转基因植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其是一种增强植物根系生长发育并延缓叶片衰 老的转基因植物的培育方法。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，其总面积、总产量及总贸易额均居粮食作 物之首。小麦产量的提高对世界粮食安全具有极其重要的作用。氮是作物必需的营养元 素，自20世纪80年代W来，氮肥在小麦生产中的投入成为其增产的有力措施之一，但是大 量氮肥的投入，不仅降低了氮素利用效率，同时也带来了资源的浪费W及水体的富营养化 等一系列环境问题，威胁人类健康和生态环境安全。目前人们在两个方面进行调节来提高 氮素利用效率，一是提高根质膜对NH4+的吸收能力；二是改进对氮敏感性高的根部结构， 即扩大根的吸收面积。作物地上部及生长能力与地下部根系活力直接相关。根系发达、分 布深广、活力强、不早衰是营养物质吸收合成运转正常、叶色青翠、谷草比值高的可靠保证。 根系活力强，叶片功能期持续时间长，叶绿素含量下降速度慢，是作物最终获得高产的可靠 保障。因此，培育发达的根系植物，有利于植物从±壤中获取养分和水分，从而促进植物的 生长发育和产量形成。
[0003] 根系既是植物从±壤中吸收养分和水分的器官，也是很多物质同化、转化或合成 的场所，还是与地上部进行物质交流的代谢器官。根系状况直接影响着地上部分的生长发 育及产量的形成，是制约小麦产量潜力进一步发挥的关键因素。对于如何利用根系改良在 小麦运种重要粮食作物的生产实践中克服水分、养分和气象条件限制，充分发挥小麦增产 潜力，人们已发现和掌握的知识、技术手段还极为有限。谷氨酷胺合成酶（GS)在高等植物氮 代谢中起着重要的作用，是催化谷氨酸和氨形成谷氨酷胺进行氮代谢过程中的关键酶；高 等植物中谷氨酷胺合成酶分为胞质型（GSl)和质体型（GS2)两大类；GSl主要同化从±壤 吸收的初级锭及再同化植物体内N循环途径释放的锭，在植物组织中广泛存在；GS2可W 同化光呼吸过程所释放的氨，主要存在于叶绿体等质体中。目前在国内外尚未有关于增强 GS在植物中表达增强根系发育，延缓生育后期植株衰老的技术方案的相关技术报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种增强植物根系生长发育并延缓其衰老的基 因及利用此基因构建转基因植物的方法，转基因植物能够明显促进根系的生长和发育，并 在生育后期明显增强功能叶片的光合作用，延迟叶片叶绿素的降解，延缓转基因植株的衰 老，进而提高作物产量。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0006] 与植物根系发育及延缓衰老相关的基因，其核巧酸序列如序列表中的SEQIDNO: 1所示。
[0007] 上述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO :2所示。
[0008] 上述基因的启动子，其核巧酸序列如序列表中的SEQ ID NO :3所示。
[0009] 上述基因的扩增引物，其正向引物的核巧酸序列如序列表中的SEQIDNO:4所示， 其反向引物的核巧酸序列如序列表中的SEQIDNO:5所示。
[0010] 上述启动子的扩增引物，其正向引物的核巧酸序列如序列表中的SEQIDNO:6所 示，其反向引物的核巧酸序列如序列表中的SEQIDNO:7所示。
[0011] 增强植物根系生长发育并延缓其衰老的方法，将SEQIDNO:1所示基因导入倒目 的植物体内并稳定表达和遗传，得到与非转基因对照植物相比根系发育增强且延缓衰老的 转基因植物。
[0012] 作为上述方法的一种优选技术方案，首先构建含有SEQIDNO: 1所示基因的重组 表达载体，然后利用所得重组表达载体构建目的植物，鉴定筛选阳性植株，得到与正常植物 相比根系发育增强且衰老放缓的转基因植物。
[0013] 作为上述方法的一种优选技术方案，构建重组表达载体的方法如下：先将权利 要求1所述的TaGS2-Al基因连接在表达载体pUBI:cas的化iquitin启动子下，然后将 TaGS2-Al自身启动子替换化iquitin启动子，最终构建成为具有自身启动子+基因的重组 表达载体pTaGS2: : TaGS2-Al。
[0014] 作为上述方法的一种优选技术方案，构建目的植物的方法如下：将正确连接目的 基因的重组表达载体和带有Bar基因的pAffi：25载体用基因枪轰击的方法转化小麦的幼胚， 经过幼胚诱导、高渗培养、打枪和恢复培养过程，将转化后的小麦幼胚愈伤置于含有双丙氨 憐的筛选培养基上进行分化筛选，具有除草剂抗性的幼芽伸长、生根、练苗移栽，得到TO代 转基因植株。
[0015] 作为上述方法的一种优选技术方案，鉴定筛选阳性植株的方法如下：根据重组质 粒pTaGS2-TaGS2-Al载体上的序列设计扩增引物，其正向引物的核巧酸序列如序列表中的 SEQIDNO:8所示，其反向引物的核巧酸序列如序列表中的SEQIDNO:9所示；反应条件为 94°C2min，98°C10s，53°C30s，68°C3min，39 个循环，68°C延伸 7min,通过凝胶 电泳图谱鉴定筛选阳性植物，然后PCR追踪检测每代自交繁种，确保目的基因稳定遗传，得 到T3、T4代稳定转基因株系。
[0016] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：转基因植物能够明显促进根系的生长 和发育，并在生育后期明显增强功能叶片的光合作用，延迟叶片叶绿素的降解，延缓转基因 植株的衰老，进而提高作物产量。详细的试验数据参见实施例及其附图。
【附图说明】
[0017] 图1是重组表达载体pTaGS2-TaGS2的结构示意图。
[0018] 图2是过表达TaGS2-Al转基因小麦的PCR检测图；图中：1、转基因株系0EGS2-51， 4、转基因株系0EGS2-52,5、转基因株系0EGS2-53,8、转基因株系0EGS2-57,9、转基因株系 0EGS2-61，10、转基因株系0EGS2-94,12、为阴性对照（未转化科农199)，13、为阴性对照（空 载体植株)，14、阳性对照(质粒)，M、marker。
[0019] 图3是在两种供氮水平下过表达TaGS2-Al转基因小麦GS活性表现图。
[0020] 图4是转基因小麦和对照在正常供氮水平下根系生长情况图。
[0021] 图5是转基因小麦和对照在正常供氮水平下根系生长情况图。
[0022] 图6是转基因小麦在低氮（a、c)和正常供氮供应水平（b、d)下的侧根和不定根生 长情况图。
[0023]图7是低氮和正常供氮水平下转基因系和对照在开花后旗叶叶绿素含量变化情 况图。
[0024] 图8是低氮和正常供氮水平下转基因系和对照在开花后旗叶叶绿素含量变化情 况图。
[0025]图9是低氮和正常供氮水平下转基因系和对照在灌浆期旗叶的光合作用图。
[00%] 图10是低氮和正常供氮水平下转基因系和对照小麦的产量表现图。
【具体实施方式】
[0027]W下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市 售产品，均能够通过市场购买直接获得。
[0028] 实施例l、TaGS2蛋白及其编码基因的发现 首先根据小麦GS2化igeneTa. 24748的EST序列拼接全长，并根据其保守序列设计GS2基因引物，用小偃54基因组DNA作模板，筛选出适用于基因组扩增的引物，并将扩增产 物初步测序。然后根据所得到的序列设计引物，用于筛选小偃54BAC文库。将筛选得到 的BAC单克隆质粒进行测序，最终得到1个TaGS2基因，分布在小麦的A基因组上，命名为 TaGS2-Al〇
[0029] 根据TaGS2-Al基因的基因组序列设计引物，W小麦(小麦品种小偃54)cDNA为模 板扩增目的片段。测序后获得1条约1. 3化的CDNA序列（SEQIDNO:1)，其含