一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法
【技术领域】
[0001]
本发明涉及一种利用藻油制备富含ω-3脂肪酸磷脂的方法。
【背景技术】
[0002]磷脂(phospholipid, PL)是一类具有疏水基团和亲水基团的非极性物质，主要是由磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PS)、溶血磷脂(由PE、PC、PS、PI和PS脱去一个脂肪酸)等组成的混合物。根据磷脂的性质与功能，磷脂可作为乳化剂、分散剂、抗氧化剂、润滑剂、营养剂等而广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。当前世界每年生产乳化剂的产量达25万吨以上，其中磷脂占总量的20%左右。我国市售磷脂乳化剂主要来自大豆磷脂，存在产品种类单一、缺乏必需脂肪酸、应用产品窄等缺点，直接或间接影响了食品、医药、饲料等领域的发展。众所周知，ω-3脂肪酸(如亚麻酸(ALA，18: 3η-3)、十八碳四烯酸(SDA, 18: 4η_3)、二十碳五烯酸(ΕΡΑ，20: 5η_3)和二十二碳六烯酸(DHA，22:6n-3)是人体的必需脂肪酸，它们具有促进婴幼儿生长发育、增强人体免疫力、抗肿瘤、预防中风和痛风等方面的生物学功能。因此，开发富含ω-3脂肪酸的磷脂作为乳化剂或添加剂应用到食品、医药等领域是当前研发改性油脂领域的热门方向之
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[0003]当前，生产富含ω-3脂肪酸磷脂的主要技术是化学催化法和酶催化法。ShijiHama等(Shiji Hama et al, 2015)指出化学催化法用于生产ω-3脂肪酸磷脂，具有反应慢和消耗昂贵的催化剂，而且高温下易导致油的氧化，进而产生副产物、色变等现象。酶催化制备富含ω-3脂肪酸的功能性磷脂，可以克服化学催化法的缺点，具有高效、专一、反应条件温和、副产物少、重复利用酶等优点，将是当前研发和今后应用于工业化生产的首选技术。欧美、日本、韩国等发达国家在油脂改性及其工业化应用的研究一直处于领先地位(Haraldsson and Thorarensen, 1998; Garcia et al, 2008;Marsaouri et al,2013;Zhao et al, 2014)。但这些发达国家的研究者主要利用大豆磷脂或磷脂酰胆碱和过量的高纯度(高于78 %) ω-3脂肪酸或纯的ω-3脂肪酸乙酯为原料，通过酶的酸解反应或转酯化反应将ω-3脂肪酸替换磷脂上的脂肪酸；优化后，ω-3脂肪酸含量可达12.3%-57.4%。在中试或规模化水平上，该方法是不可行的，主要原因是原料中需要精制的ω-3脂肪酸成本过高。我国关于开发富含ω-3脂肪酸的磷脂，暂处于起步阶段。如，南方科技大学的Li等(Li et al, 2014)也是通过上述方法获得ω-3脂肪酸含量为30.7 %的大豆磷脂酰胆碱。因此，研究开发富含ω-3脂肪酸的功能性磷脂应用到食品、医药等领域，具有重要的意义。
[0004]富含ω-3脂肪酸的可食用油主要是鱼油和海洋微藻藻油。近年来，水产养殖业消耗了全球83 %的鱼油，人类直接食用鱼油仅占总量的6 %。2015年6月，FAO Globefish已公布了鱼油的价格为2400 $/吨，比去年鱼油价格高了 300$/吨。高价格的鱼油直接制约了开发富含ω-3脂肪酸的功能性油脂。富含ω-3脂肪酸的磷脂主要是虾油、海鱼鱼油和海洋微藻藻油。磷脂是组成动物组织细胞膜的重要成分，其含量较低。此外，基于海洋食物链角度分析，海鱼富集ω-3脂肪酸主要来自富含ω-3脂肪酸的海洋微藻。近年来，欧盟国家已利用等鞭金藻、微绿球藻、螺旋藻等藻粉作为添加剂，以提高意大利面和饼干的营养价值。大量文献表明，微绿球藻具有生长速度快，油脂含量高，富含ω-3脂肪酸，其中磷脂含量可达 30% (Ryckebosch et al, 2014; Yao et al, 2015)。因此，富含 ω-3 脂肪酸的藻油是用来开发高营养价值的功能性磷脂的最佳油源，可以克服当前油源短缺问题。
[0005]国内外对开发功能性磷脂还面临如何筛选具有专一性强、催化效率高、绿色环保和富集高含量ω-3脂肪酸的脂肪酶。目前常用的商用脂肪酶有非选择性的固定化脂肪酶(如，Novozyme 435，CALA等)、1，3选择性的酶(如TL IM, RM IM,等)和磷脂酶PLA1。寻找具有水解磷脂的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的脂肪酶，是当前开发富含ω-3脂肪酶的功能性磷脂的难题。2011年，丹麦奥胡斯大学的Xuebing Xu教授研究CALA脂肪酶的生物印记发现:在乙醇条件，该酶能水解油脂的8个碳链和油酸；但他们未进一步利用该酶对其ω-3脂肪酸的选择性进行综合分析。因此，本专利以富含ω-3脂肪酸的藻油磷脂为底物，从多种酶中筛选并研发出具有高效地富集ω-3脂肪酸的功能性磷脂。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是以富含ω-3脂肪酸的藻油为原料，利用绿色环保的的脂肪酶催化法制备富含ω-3脂肪酸的磷脂。
[0007]为实现本发明的目的而采用的技术方案和步骤是:
1、藻油提取。
[0008]称取一定量的微藻藻粉，以质量分数为60-100%乙醇作为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪进行萃取，萃取温度为55?120 °C,萃取时间25?85 min，萃取次数为2?5次。萃取结束后将萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
[0009]本发明所述的微藻，是指裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻以及杜氏藻。
[0010]2、藻油磷脂的分离。
[0011]将上述获得的藻油，以藻油:丙酮的体积比为1:10加入食品级丙酮，充分混匀，30min后，4000 rpm/min离心lOmin，所得沉淀物为藻油磷脂粗品。
[0012]本步骤重复三次。
[0013]3、磷脂酰胆碱的纯化。利用硅胶色谱柱分离上述藻油磷脂粗品得到纯化的磷脂酰胆碱。
[0014]I)用质量分数为95%乙醇洗脱色谱柱分离去除含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸。
[0015]2)用质量分数为80%乙醇洗脱色谱柱分离获得纯度高于85%的磷脂酰胆碱。
[0016]4、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的合成。
[0017]将上述提取的藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱与乙醇混合，再加入脂肪酶和适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备得到富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂液。反应条件为:藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱和乙醇的质量比1:1?4、脂肪酶的加入量占藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱质量的5?18%、加水量占藻油磷脂粗品或磷脂酰胆碱质量的O?15 %、反应温度25?55 °C、反应时间为6h?72h，搅拌速度500r/min。
[0018]所述的脂肪酶是指固定化脂肪酶A-CALA或游离脂肪酶A ;
所述的固定化脂肪酶A-CALA购自美国CODEIX公司，游离脂肪酶A购自丹麦诺维信公司。
[0019]5、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的提纯。
[0020]将上述反应产物功能性溶血磷脂液与食品级正己烷按1:9的体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂。
[0021]采用本发明专利所述的工艺条件，以藻油磷脂粗品为合成原料时，酶催化反应后溶血磷脂中ω-3脂肪酸的总含量可达40%以上。以磷脂酰胆碱为合成原料时，酶催化反应后溶血磷脂中ω-3脂肪酸的总含量可达60%以上。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
1、提取藻油。称取1g微绿球藻藻粉，以质量分数为75%乙醇为萃取剂，利用加速溶剂萃取仪萃取，萃取条件为:温度100°C、重复提取3次、处理时间35 min。萃取结束后萃取液置于真空旋转蒸发器将有机溶解蒸发，蒸发后所得剩余物即为藻油。
[0023]2、藻油磷脂的分离。将上述获得的藻油，以藻油:丙酮为1:10加入食品级丙酮，充分混勾30min后，4000 rpm/min离心lOmin，所得沉淀物为藻油磷脂粗品。本步骤重复三次。
[0024]3、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的纯化。利用上述提取的藻油磷脂粗品与乙醇混合，再加入固定化脂肪酶A-CALA和适量的水，利用脂肪酶醇解反应制备富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂液，反应条件为:藻油磷脂粗品和乙醇的质量比1:3、反应温度450C、固定化脂肪酶A-CALA加量占藻油磷脂的质量12%、含水量占藻油磷脂质量的2%、反应时间24h，搅拌速度500r/min。
[0025]4、富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂的提纯。将上述反应产物功能性溶血磷脂液与食品级正己烷按1:9的体积比例混合提取3次，收集乙醇相，旋转蒸发去除乙醇和水后获得富含ω-3脂肪酸的功能性溶血磷脂。
[0026]本实施例所述的固定化脂肪酶A-CALA购自美国CODEIX公司。
[0027]采用本发明专利所述的工艺条件，酶催化反应后溶血磷脂中ω-3脂肪酸的总含量达43 %。
[0028]