一种人血小板同种抗原系统基因分型的pcr-sbt方法及试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于人血小板同种抗原系统（Human PlateletAlloantigen，缩写为HPA)的抗原基因分型的分子生物学检测方法及该方法所用 的试剂。
【背景技术】
[0002] 血小板表面存在复杂的血型抗原，它不仅存在与红细胞共有的AB0、H、Lewis等 糖链类抗原和与白细胞共有的HLA-I类抗原，还存在血小板自身特异性的同种抗原系统 化umanplateletalloantigen,HPA)，人群中HPA系统表现出高度的遗传多态性。个体间 HPA抗原的不同可通过免疫刺激而产生抗体，抗体能与供者相对应抗原相结合从而破坏血 小板，导致血小板输注无效和其他相关性疾病，因此研究血小板同种抗原系统具有重要的 意义，有助于疾病诊治和解决血小板输注问题。研究显示HPA基因定位于血小板糖膜蛋白 和CD109基因上，目前共发现有28个抗原系统。
[0003] 血小板同种抗原的差异可导致个体受免疫刺激产生抗体，已发现其抗体与多种疾 病有关，包括新生儿同种免疫性血小板减少症、血小板输注无效和输血后紫薇等。其中血小 板输注无效在临床输血治疗中常见，也是目前血小板输注中需要研究解决的热点问题。国 内外已建立一些方法解决血小板输注无效，近年来国内开始建立献血者血小板同种抗原基 因数据库，拟提供与患者血小板抗原系统基因型相合的献血者，W解决血小板输注无效问 题。
[0004]目前HPA抗原基因分型最主要的方法是多聚酶链反应-序列特异性引物 (PCR-SSP)，该方法针对同一抗原系统需要设计两对引物进行扩增才能有效区分，因此对检 测HPA的多个系统需要扩增的孔位较多，此外PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具 有区别性的特异性位点进行设计，因此对于一些特殊的新突变位点难W明确。而HPA系统 的PCR-SBT (PCR-Sequence based typing,基于PCR测序的分型技术）分型方法可W克服 上述局限性和不足，为目前最准确的分型的方法。但现阶段的HPA抗原基因PCR-SBT分型 方法还不够完善，虽然也有实验室采用PCR-SBT的方法对HPA抗原进行基因分型，但至今未 对HPA1-28W系统进行系统分型。因此，建立HPA1-28W系统的PCR-SBT分型方法具有重要 的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明首先要解决的技术问题是提供一种人血小板同种抗原系统基因分型的 PCR-SBT方法，W克服现有分型技术中的上述不足之处。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是；一种人血小板同种抗原系统基因 分型的PCR-SBT方法，对HPA抗原系统的基因进行分型，并包括W下步骤： (1)制备人基因组DNA; (2) 提供扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DM中抗原系统的基因序列； (3) 将步骤（2)得到的扩增产物进行双酶切纯化； (4) 提供测序引物，将步骤（3)得到的纯化产物进行测序PCR反应； (5) 将步骤（4)得到的测序产物进行醋酸钢-己醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序； (6) 将步骤（5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
[0007] 进一步地，所述HPA抗原系统为HPA1-28W抗原系统，所述的HPA1-28W抗原系统 的基因为；HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6W、HPA-7W、HPA-8W、HPA-9W、HPA-lOw、HPA-IIw、HPA-12w、HPA-13w、HPA-Hw、HPA-15、HPA-16W、HPA-17W、HPA-18W、HPA-19W、 HPA-20W、HPA-21W、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-2化w、HPA-26bw、HPA-27bw、 HPA-28bw〇
[000引进一步地，所述步骤（2)中的扩增引物为：
[0009] 所述步骤（4)中的测序引物为6条寡核巧酸测序引物，其序列如下：
[0010] 所述步骤（3)中纯化所需的两种酶为奸碱性磯酸酶和核酸外切酶I。
[0011] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种人血小板同种抗原系统基因分型 的PCR-SBT方法所用的试剂，所述抗原系统为HPA1-28W抗原系统，由28个抗原基因组成： HPA-I、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6W、HPA-7W、HPA-8W、HPA-9W、HPA-lOw、HPA-IIw' HPA-12W、HPA-13W、HPA-14W、HPA-15、HPA-16W、HPA-17W、HPA-18W、HPA-19W、HPA-20W、 HPA-21W、HPA-22bw、HPA-23bw、HPA-24bw、HPA-2化W、HPA-2化W、HPA-2化W、HPA-28bw，所述 试剂由用于扩增28个HPA抗原基因的18个扩增引物和用于测序分析的6个寡核巧酸测序 引物组成； 所述用于扩增的引物为：
[0012] 本发明中引物的设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特 网上免费获得。本发明所设计的寡核巧酸引物是根据GenBank中人类HPA抗原基因序列 中包括多态性位点在内的连续寡核巧酸序列而设计获得的。HPA-(IUOw)、（4、16w、19w)、 (6w、7w)、（8w、llw、2化w、23bw)、（14w、2化W)、17w抗原系统的；[TGB3基因序列的扩增引物根 据GenBank中编号为NC_000017. 10 (45331208. . 45390077)的序列设计；HPA-2 抗原系统 的GPlBA基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000017. 10 (4835312-4838325) 的序列设计；HPA- (3、9w、27bw)、20w、22bw、24bw、28bw抗原系统的口GA2B基因序列的扩 增引物根据GenBank中编号为NC_000017. 10 (42449550-42466873)的序列设计；HPA-5、 13w、18w、25bw抗原系统的口GA2基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000005. 9 (52285156-52390609)的序列设计；HPA-12W抗原系统的GPlBB基因序列的扩增引物根据 GenBank中编号为NC_000022. 10 (19711066-19712297)的序列设计；HPA-15 抗原系统的 CD109基因序列的扩增引物根据GenBank中编号为NC_000006. 11 (74405508-74538041) 的序列设计。正向扩增引物5'端依据后续组合情况分别连接有M13载体正向序列 上的18个碱基序列TGTAAAACGACGGCCAGT、PCMVF-BD正向序列上的20个碱基序列 TCTAAAAgCTgCggAATTgT、PDC316正向序列上的18个碱基序列AC^gggTATAAg AggCg，反向 扩增引物5'端连接有M13载体反向序列上的18个碱基序列CAGGAAACAGCTATGACC，PCMV反 向序列上的20个碱基序列TCCAAA CTCATCAATgTATC, pDC316反向序列上的18个碱基序列 CgATgCTAgACgATCCAg。（接头引物可W互换，但同一组内应不同） 本发明W18对寡核巧酸引物分别扩增HPA1-28W系统的18个基因片段。其中HPA-(1、lOw)、（4、16w、19w)、巧w、7w)、（8w、llw、2化w、23bw)、（14w、26bw)、17w抗原系统的引物分 别扩增GenBank编号为NC_000017. 10 (45331208-45390077)序列中 38146-38581 位、 39382-39881 位、46946-47640 位、55361-56610 位、54198-54622 位、41201-41497 位的片 段；HPA-2抗原系统的引物扩增GenBank编号为NC_000017. 10 (4835312-4838325)序列 中的1340-1611位的片段；HPA- (3、9w、2化W)、20bw、22bw、24bw、28bw抗原系统的引物分 别扩增GenBank编号为NC_000017. 10 (42449550-42466873)序列中的 16284-16691 位、 13235-13816 位、6633-7131 位、11457-11833 位、15593-15977 位的片段；HPA-5、13w、18w、 25bw抗原系统的引物分别扩增GenBank中编号为NC_000005. 9 (52285156-52390609) 的序列中 89121-89571 位、99408-99889 位、96519-96861 位、113383-113693 位的片段； HPA-12W抗原系统的引物扩增GenBank编号为NC_000022. 10 (19711066-19712297)序 列中209-661位的片段；HPA-15抗原系统的引物扩增GenBank编号为NC_000006. 11 (74405508-74538041)序列中的107619-107872位的片段，可保证28个抗原系统基因的有 效扩增。扩增引物