基于荧光染料法数字微滴pcr检测血液中结核杆菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于结核杆菌检测技术领域，尤其涉及一种基于荧光染料法数字微滴PCR检测血液中结核杆菌的方法。
【背景技术】
[0002] 数字微滴PCR(digitaldropletPCR，ddPCR)是近年来新出现的一种PCR技术。在 原有PCR[PolymeraseChainReaction(聚合酶链反应），简称PCR]技术的基础上，该技术 进行了大幅革新。该技术将传统PCR中的每一份样品反应体系均分为20000个独立微滴， 然后再进行PCR反应。在制作微滴时，只有部分微滴可以包裹到目的基因。PCR反应结束后 用设备检测所有微滴的荧光信号值。再根据荧光信号的阈值来区分每一个微滴的信号值， 高于阈值的微滴信号值判定为该微滴包裹到了目的基因，称为阳性微滴。低于阈值的微滴 信号，判定为该微滴没包裹到目的基因，称为阴性微滴。最后经过设备统计阳性微滴数，并 自动计算后得出目的基因拷贝数。
[0003] 结核杆菌感染人体，按发病部位不同主要分为肺结核与肺外结核两大类。传统的 结核杆菌检测方法常用痰涂片法。
[0004] 申请号为201110153090. 4的中国专利申请公开了一种检测痰液中结核杆菌的方 法，该方法将痰液薄层均匀涂在2-3张玻片上，固定并染色，然后通过酸性酒精脱色和复 染，用摄像头对玻片进行扫描图像、分割，提取分割后细胞的形状特征，利用计算的特征值 对细胞进行自动分类，从而检测出痰液中是否存在结核杆菌。该方法需要每毫升痰中至少 含有5000-10000个细菌才可以检测出，且检测敏感性欠佳。痰培养法常作为肺结核诊断的 "金标准"，但费时较长，需要2-8周时间，容易导致患有结核病的患者错过早期治疗的最佳 时机，导致疗程加长，且治疗副作用加重，增加病人痛苦和经济负担。
[0005] 更重要的是，在结核病中，肺外结核大约占20%。包括骨结核、肾结核、肠结核等 等。对于肺外结核而言，由于病灶处结核菌数量较少、难以获得各器官的检测样本、无法进 行痰检等原因，使得检测过程异常艰难。因此往往需要多种检测方法共同使用后，方可在一 定程度上作出诊断，整个检测过程尤显繁琐、低效。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供一种基于荧光染料法数字微滴PCR检测血液中 结核杆菌的方法。所述方法运用数字微滴PCR检测血液中是否含有结核杆菌，灵敏度高，检 测快速。
[0007]本发明的技术方案如下：一种基于荧光染料法数字微滴PCR检测血液中结核杆菌 的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤⑴采集血液，提取血液中的总DNA;
[0009] 步骤（2)将总DNA进行数字微滴PCR反应，反应结束后，检测所有微滴的荧光信 号值并设定阈值，根据阈值确定微滴是否包裹结核杆菌DNA，高于阈值的微滴包裹结核杆菌 DNA，为阳性微滴，低于阈值的微滴不包裹结核杆菌为阴性微滴；
[0010] 步骤（3)统计阳性微滴数，计算得出结核杆菌DNA的拷贝数，继而得到血液中结核 杆菌DNA的总拷贝数，从而判断血液中是否含有结核杆菌。
[0011] 本发明基于荧光染料法数字微滴PCR检测结核杆菌的原理为：首先提取出血液中 总DNA，血液中既有宿主（人或动物）的DNA也有结核杆菌DNA，将总DNA进行数字微滴PCR， 数字微滴PCR在传统PCR技术基础上，将每一份样品反应体系均分为20000个的独立微滴， 然后再进行PCR反应；在制作微滴时，只有部分微滴可以包裹到结核杆菌DNA。数字微滴 PCR可以对极微量的结核杆菌DNA片段进行特异性扩增，同时进行绝对定量，得到样品中极 低含量结核杆菌DNA的确切拷贝数，从而可以判断血液中是否含有结核杆菌。
[0012] 步骤（1)提取血液中的总DNA的过程如下：
[0013] 步骤（a)血液中加入pH为8的TES缓冲液和5%的SDS溶液后，先置于36~37°C 水浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液；
[0014] 步骤（b)在混悬液中加入pH4. 8的醋酸钠溶液和0. 05mol/L的葡萄糖溶液，冰上 放置10~20min;然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中 加入氯仿/异戊醇提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，-20°C沉淀30min，离 心得到总DNA。
[0015] 血液中DNA包括宿主DNA和结核杆菌DNA。由于结核杆菌细胞壁比较难破坏，难以 提取结核杆菌DNA，如何破坏结核杆菌细胞壁是本发明需要克服的一大技术难题。本发明在 使用细胞裂解液的基础上加入溶菌酶，并在沸水浴反应，从而有效破坏结核杆菌DNA的细 胞壁。
[0016] 步骤（a)TES缓冲液用于裂解细菌的细胞壁，释放DNA，其中含有Tris-HCl(三羟甲 基氨基甲烷一盐酸）、Η)ΤΑ(乙二胺四乙酸）和SDS(十二烷基磺酸钠），故简称TES;TES缓 冲液还含有溶菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL。
[0017] SDS是一种蛋白变性剂，破坏蛋白质的尚级结构。
[0018] 加入TES缓冲液后，再加5 %的SDS溶液可以使得DNA更易沉淀。
[0019]步骤（a)所述温水浴的温度为36~37°C，溶菌酶在该温度范围下活性最高，从而 裂解小鼠肺组织中结核杆菌细胞壁。
[0020] 步骤（a)沸水浴的目的有两个：第一，在裂解细胞的工作完成后，为了避免溶菌酶 继续反应，产生高温使得溶菌酶失活。第二，沸水浴条件下，也可使溶菌酶裂解不充分的结 核杆菌细胞壁得到进一步破碎，从而进一步提高DNA得率。
[0021] 步骤（b)所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液中苯酸、氯仿和异戊醇体积比为25 :24 :1， 所述氯仿/异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24 :1。
[0022] 步骤（a)和步骤（b)中所述离心条件为12000r/min,离心lOmin。
[0023] 步骤（b)加入乙醇充分震荡后，在低温条件下可使得DNA更容易沉淀，且可保护 DNA不被降解。
[0024] 步骤（2)数字微滴PCR使用的引物是本发明以结核菌特有基因IS6110(GenBank 编号：X52471)为模板设计出的，序列如下：
[0025]前引物：5 ' 一AGAAGGCGTACTCGACCTGA- 3 '，
[0026]后引物：5 ' 一CTGAACCGGATCGATGTGTA- 3 '。
[0027]步骤（2)数字微滴PCR反应体系中，2XQX200ddPCREvaGreenSupermix、DNA模 板、前引物、后引物和水的体积比为10 :2 :0. 2 :0. 2 :7. 6。
[0028]所述 2XQX200ddPCREvaGreenSupermix是ddPCR反应所需的混合试剂，由 Bio-Rad公司生产销售。
[0029] 步骤（2)数字微滴PCR反应条件如下：在95°C进行酶激活，激活时间为5min，循 环1次；95°C变性30s，52°C退火lmin，变性与退火循环35次；在4°C下信号稳定lmin，稳定 5min，循环1次；在90°C下信号稳定lmin，稳定5min，循环1次；在4°C下保温，循环1次。
[0030] 步骤（3)微滴具有荧光信号，包裹宿主DNA和包裹结核杆菌DNA的微滴的荧光信 号值不同，初始阈值是ddPCR实验设备自行设定的，然后根据阳性对照组和阴性对照组微 滴信号图中的阴、阳性微滴分布情况来修正并最终划定阈值；阈值根据微滴的荧光信号值 将包裹宿主DNA的液滴和包裹结核杆菌DNA的液滴划分开。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0032] 1、本发明提供的方法取样方便快捷，仅需采集微量（200μ1)血液即可检测出微 量结核菌的存在，灵敏度达到可检测出每微升血液中所含结核菌DNA的确切拷贝数；
[0033] 2、本发明提供的方法准确率高，检测快速，仅需2小时就可完成检测过程。
【附图说明】
[0034] 图1为阳性对照组ddPCR微滴信号分布图；
[0035] 图2为阴性对照组ddPCR微滴信号分布图；
[0036] 图3为实施例lddPCR微滴信号分布图；
[0037] 图4为实施例2ddPCR微滴信号分布图；
[0038] 图5为对比例ddPCR微滴信号分布图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0040] 本发明的技术方案由云南省高校热带传染病重点实验室、云南省热带传染病示 范型国际科技合作基地、云南省公共卫生与疾病防控协同创新中心支持，并在以下基金 项目的支撑下完成，基金项目：国家自然科学基金资助项目（N〇:81060134;81371835; 31560051 ;81560596);云南省自然基金项目（No. 2010CD221，2011FB244,2012FB011， 2013FZ057,2014FA011, 2014FB001)。
[0041 ] 在以下实施例中，pH为8的TES缓冲液试剂的配制过程：
[0042]三种成分浓度比例如下：pH8.OTris-HCl10mmoL/L，EDTAImmoL/L，SDS0·ImmoL/ L，配制1L的TES缓冲液时，按上述浓度比例计算，需要加入pH8. 0的Tris-HCl10ml，EDTA 0. 29g，SDS0. 028g，然后用超纯水将上述成分溶解并定容到1L的体积，最后用微量NaOH调 整pH值到8.0。
[0043] 实施例中以结核菌特异基因IS6110(GenBank编号：X52471)为模板设计引物序 列，由上海生工科技公司合成；"2XQX200ddPCREvaGreenSupermix试剂"由Bio-Rad中 国公司提供；QX100?DropletDigital?PCRSystem(QX100数字微滴PCR系统）实验设 备由Bio-Rad中国公司提供。
[0044] 对比例
[0045] 采集正常人外周血液本29份，作为正常对照组，每份血液按照如下步骤进行提取 DNA：
[0046] 步骤（1) 200μ1血液中加入TES(PH为8,含溶菌酶浓度为20mg/ml) 200μ1和5% (W/V)SDS溶液120μ1，在36°C水浴中40min，沸水浴中60min，冰上放置5min，得到混悬液；
[0047] 步骤⑵混悬液中加500μ1PH4. 8的NaAc(醋酸钠）和100μ10. 05mol/LG(葡 萄糖），颠倒混匀，冰上放置15min分装成两管，每管加入600μ1苯酚/氯仿/异戊醇