基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学与临床医学技术领域，特别是一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法。
【背景技术】
[0002]适配子是一种ssDNA或RNA分子，它能高亲和力高特异性结合多种靶分子，如:蛋白质、氨基酸、药物、金属离子、细胞等。适配子类似于抗体，但比抗体更易合成和保存，因此适配子有代替抗体用于基础研究和临床诊疗的潜力。
[0003]适配子是通过SELEX技术筛选获得。ssDNA次级文库的制备是SELEX技术的关键步骤。目前ssDNA次级文库制备的方法主要有:不对称PCR，生物素链霉亲和素分离法，核酸外切酶消化法等。
[0004]不对称PCR扩增产物含目的ssDNA、dsDNA和副产物。需要通过变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，把目的ssDNA与dsDNA和副产物分离开，在胶回收纯化过程中会导致目的ssDNA的大量丢失；同时如果副产物较多，易与目的ssDNA融合形成涂抹带，不能把ssDNA分离开，从而得不到较纯的目的ssDNA次级文库。
[0005]生物素链霉亲和素分离法是使用生物素标记其中一条引物进行PCR扩增，扩增产物通常含生物素标记的dsDNA，生物素标记的副产物和无生物素标记的副产物。扩增产物与链霉亲和素磁珠结合，将生物素标记的产物分离出来，再通过碱变性使未标记生物素的ssDNA分离出来。该法的缺点是分离出的ssDN A含有一定量的副产物，同时分离出的ssDNA在高pH值的碱溶液中，回收纯化可导致ssDNA的损失。
[0006]核酸外切酶消化法是利用核酸外切酶消化PCR扩增产物，使dsDNA转化成ssDNA，消化结束后，用变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，纯化回收。在纯化回收的过程中易导致目的ssDNA大量丢失。
[0007]以上三种方法还有一个重要的共同缺点:在这些方法中PCR扩增是的一个关键步骤，PCR扩增产物的质量直接影响到次级ssDNA文库的质量。PCR扩增随机ssDNA不仅优化过程繁琐，而且不可避免的产生副产物，不仅使扩增效率下降，还造成潜在的高质量的适配子丢失。
[0008]传统的PCR方法效率低下是由于随机寡核苷酸文库极为丰富多样，扩增时库容量为109左右，不同产物间的杂交而形成非特异性扩增是PCR过程中一个难以避免的重要问题。随机文库PCR与只扩增一种目的模板的常规PCR差异巨大，Musheev等发现当产物达到峰值时，仅多扩增5个循环就能使目的产物完全转变为非特异性产物，而主要的非特异性产物可能是产物与产物间的杂交，形成ssDNA-dsDNA，产物和产物的杂交又可使潜在的高亲和力、高特异性适配子丢失而导致筛选失败。要减少非特异性产物的产生，传统方法只有优化PCR反应条件和设计好文库的固定序列，但这些方法只能使非特异性产物有所减少，使PCR循环达到产物量最大时停止扩增，而不能从根本上解决非特异性扩增，更不能阻止产物与产物间的杂交。
[0009]总之传统PCR扩增随机ssDNA文库的缺点是:1、不同产物间的杂交和非特异性扩增无法避免。2、PCR生成的目的产物会转化为副产物，且随循环数的增加而增加，直至全部转化为副产物。3、优化反应条件步骤繁琐，且不能完全避免副产物生成。因此传统PCR用于ssDNA次级文库的制备的效率低下且不可避免导致潜在的适配子丢失。
[0010]本发明建立的乳液不对称PCR方法可彻底解决传统PCR的缺点，乳液不对称PCR通过乳液颗粒把约109个不同的模板间隔开，分别在不同的乳液颗粒中扩增，因此它们的产物不会相互杂交而产生副产物。该法不仅提高了产物量，解决了副产物问题，还不需要循环数优化，可直接扩增到35-50个循环，简单高效。
[0011]
【发明内容】
[0012]本发明为克服现有技术中存在的缺陷，提供一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，该制备方法不仅提高产物量，解决现有技术副产物问题，而且不需要循环数优化，可直接扩增到35-50个循环，简单高效。
[0013]为解决上述技术问题，本发明提供一种基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法，包括如下步骤:
S1.合成引物和随机ssDNA文库，其中上游引物无生物素标记，下游引物有生物素标记；所述随机ssDNA文库长度为90 bp，两端各为长19 bp的固定序列，中间为52 bp的随机序列。随机ssDNA文库序列为:
5' -GAACATTGGCGTCCGTGAG-N52-CACTTCCTCAAACGCCCAA-3'；
上游引物为 5' -GAACATTGGCGTCCGTGAG-3'，
下游引物为 5' -b1tin-TTGGGCGTTTGAGGAAGTG-3r。
[0014]S2.配置乳液-不对称PCR反应液:
以步骤S1中随机ssDNA文库和引物为模板和引物配置乳液-不对称PCR反应液。
[0015]所述乳液-不对称PCR 反应液 100 μ L 体系含 50 mmol/L KC1、10 mmol/L pH 8.6的 Tris-HCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L dNTP、0.6 μ mol/L上引、0.03 μ mol/L 下引、
0.04 μ g/mL 模板和 100 U/mL pfu DNA 聚合酶。
[0016]S3.乳化液的制备:
以步骤S2中的乳液-不对称PCR反应液配置乳化液，其中水相为乳液-不对称PCR反应液，油相组成为4.5% (v/v) Span 80、0.4% (ν/ν) Tween 80、0.05% (ν/ν) Triton Χ-100，其余为mineral oil (矿物油);然后进行乳化液的制作:把水相以每滴8~10 μ L的速度匀速滴入含油相的2 mL平底冷冻管中，同时用搅拌子为8X 1.5 mm的磁力搅拌器以1500 rpm的速度搅拌，当水相加完后继续搅拌20 min,得到0.3 mL的乳化液，分装入PCR反应管中；其中水相与油相的体积比为1:2 ;所述匀速滴入的时间为每0.lmL的水相滴入0.2mL油相的时间控制在1分钟左右。
[0017]S4.乳液不对称PCR扩增:
把步骤S3中的分装的装有乳化液的PCR反应管，置入PCR仪中进行扩增；反应条件为94 °C变性30 s，然后进入40个循环94 °C变性40 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸30 s,最后延伸3 min。
[0018]S5.PCR产物纯化:将步骤S4得到的PCR产物进行纯化，得到目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA的混合物。
[0019](1)用型号为28004的QIAGEN纯化试剂盒纯化产物，把步骤S4中扩增结束PCR反应管，以13000 rpm转速，离心10分钟，去除上层油相；
(2)在剩余反应液中加入5倍体积的PBbuffer至PCR产物中，混匀，加1 μ L冰醋酸使溶液变为黄色，转移至回收柱中，13000 rpm离心lmin，弃液；
(3)加入750yL PE buffer至回收柱中，13000 rpm离心lmin，弃液，再次离心lmin ;
(4)将柱子转移至新的2mL离心管，加入30~50yLEB buffer，室温静置lmin后，13000rpm离心lmin，得到纯化产物为目标ssDNA次级文库和生物素标记dsDNA混合物；
S6.链霉亲和素磁珠分离步骤S5中得到的目标ssDNA次级文库和生物素标记的dsDNA:
(1)用型号为65001的invitrogen磁珠分离，取6?7X107个链霉亲和素磁珠混悬液，加入 1.5mL 离心管，用含 10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 Mm EDTA，2M NaCl 的 2XB&W 缓冲液洗涤磁珠一次，上磁力架1?2 min，吸弃洗涤液；
(2)加入含5 mM Tris-HCl pH 7.5,0.5 Mm EDTA，1M NaCl 的 1XB&W 缓冲液重悬磁珠；
(3)加入等体积纯化的步骤S5中得到的PCR纯化产物，室温下摇床结合15min左右，上磁力架1?2 min，含生物素的dsDNA与链霉亲和素磁珠结合并吸附在管壁上，不含生物素的ssDNA游离于上清中；
(4)吸取上清，即为ssDNA次级文库。
[0020]S7.结果检测:
(1)浓度检测，使用核酸蛋白定量仪检测得到的次级文库浓度；
(2 )纯度检测，使用尿素变性聚丙烯酰氨凝胶电泳银染检测。
[0021]本发明的有益效果:
本发明首先建立乳液不对称PCR方法，应用该法扩增出无副产物的目的产物，目的产物含生物素标记的dsDNA和无生物素标记的ssDNA ;然后通过与链霉亲和素磁珠结合，将无生物素标记的产物分离出来，即为次级ssDNA文库。
[0022]本发明建立的基于乳液不对称PCR的次级文库的制备方法，克服了其它方法的副产物问题，使PCR扩增步骤简单方便，同时由于没有副产物干扰，使下游的分离步骤变得简单高效。
[0023]本发明方法的优点主要表现在以下几个方面:
1.乳液不对称PCR扩增产物无副产物，不需要聚丙烯酰氨凝胶电泳分离目的ssDNA，因而不易丢失ssDNA ；
2.分离简单方便:乳液不对称PCR扩增产物只有两种:生物素标记的dsDNA和无生物素标记的ssDNA。应用链霉亲和素磁珠结合生物素标记的dsDNA，可一步法分离出ssDNA即为次级文库，ssDNA在缓冲液中无需纯化回收，可直接用于下一轮的适配子筛选；而生物素链霉亲和素分离法则是先分离出生物素标记的dsDNA，再用碱变性从生物素标记的dsDNA分离出ssDNA，不仅使用磁珠量多，产量少，而且分离出的ssDNA在高pH值的碱溶液中，需要进一步处理才能用于下一轮适配子筛选； 3.本法得到ssDNA次级文库纯度高，接近原始文库，如附图2；
4.步骤简单，如附图1。
【附图说明】
[0024]图1为实施例1的基于乳液不对称PCR的ssDNA次级文库的制备方法流程图。
[0025]图2为实施例1中制备的次级文库与原始合成文库的对比；其中，1为原始合成文库，2为制备文库，Μ为marker。
[0026]图3为实施例1中制备的次级文库过程中乳液不对称PCR扩增过程图，从10个循环扩增到50个循环；其中，C为原始文库对照，Μ为marker。
[0027]图4为现有技术中的常规不对称PCR扩增过程图，分别从10个循环扩增