低pH的HNL突变体的制作方法

低pH的HNL突变体的制作方法
【专利说明】低pH的HNL突变体
[0001] 本发明涉及新鉴定的（R)-选择性羟基腈裂解酶（R-HNL)突变体，特别地 PaHNL5(Prunusamygdalus的羟基腈裂解酶同工酶5)的变体，其在极低的pH下（即，在2. 5 左右和更低的pH下）稳定。特别地，本发明提供编码所述突变酶的核酸、重组微生物和它 们用于工业应用的用途。
[0002] 泛酸内酯（pantolactone)外消旋物可由羟基新戊醛、氰化钠、盐酸和氯化f丐通过 化学反应来制备。化学工业中对于制造（R)-泛酸内酯有很大兴趣，因为它在（R)-泛酸钙 和（R)-泛醇合成中很重要。这两种化合物代表维生素B5前体并广泛应用于食品、化妆品 和药物中。
[0003]对于对映体纯（enantiopure)的（R)-氰醇（(R)-cyanohydrins)(例如，（R)-泛 酸内酯）的工业生产，从经济和生态这两方面而言，使用从蔷薇（Rosaceae)科植物分离的 R-HNL(例如，来自Prunusamygdalus的同工型5(PaHNL5))相较于其中外消旋物被化学转 化为（S)-或（R)-泛酸内酯的化学拆分步骤优选。
[0004] 建立包含R-HNL催化的不对称氢氰化反应步骤的工业生产方法非常有挑战：首 先，所述不对称反应必须与背景中存在的自发外消旋氢氰化反应竞争。这种"背景反应"仅 可以通过将温度降低至25°C-15°C左右来减缓且在低pH值（例如pH低于2)下几乎被抑 制。其次，不对称氢氰化仅在各底物以单体形式存在时才可能。然而，羟基新戊醛在室温和 低于室温下在水中形成稳定的二聚体，其不能被用作底物。只有苛刻的低于2的酸性pH(例 如，pH为1左右）看起来有利于单体形式，这与使用标准酶的生物转化极不相容。还可以 通过应用高温（例如，至少65°C)或在水中高度稀释底物来水解二聚体，这些条件同样与 HNL-催化的不对称氢氰化反应不相容。因此，在将底物加入酶促反应混合物中之前，利用高 温和低pH条件来产生活性单体形式的二聚体形式的底物的"预单体化"步骤是必要的。
[0005] 能够催化羟基新戊醛朝向相应的（R)-氰醇（其可通过酸催化的水解被进一步转 化为（R)-泛酸内酯）的立体选择性转化的天然R-HNL酶已被知晓超过15年（参见例如， Effenberger等人，Tetrahedron:Asym. 1995,6, 271-282)。天然（R)-HNL制剂递送（R)-泛 酸内酯的产率（84% )和选择性（S卩，对映体过量（89%ee))均不足。此外，这些酶在低pH 下不稳定且需要使用有机溶剂。
[0006] 成熟PaHNL5酶序列中第317位氨基酸的替换产生重组酶PaHNL5_V317A(参见TO 2008/071695)，在低pH下和水中，其的羟基新戊醛朝向相应的（R)-氰醇的转化为使用天然 酶时的13倍。然而，由于其在pH2. 5时的半稳定性持续较长的时期，所以在上述苛刻条件 下，其对于工业方法仍然不是非常有效。
[0007] 因此，持续需要在低pH和低温下有活性且稳定的R-HNL变体以进行各底物的不对 称氢氰化，例如羟基新戊醛朝向相应的（R)-氰醇，同时避免与不对称反应竞争的背景反应 和二聚体形成。
[0008] 出乎意料地，我们现在鉴定出了对R-HNL在上述条件（例如，建立（R)-泛酸内酯 立体选择性生产的工业方法所需的2. 5左右的pH和在15-25°C的温度）下的稳定性和活 性起重要作用的氨基酸位置。已基于SEQIDN0:1所示的成熟PaHNL5产生了重组酶，其在 第317和496位带有氨基酸替换，其中SEQIDNO:1对应于EP1223220中的SEQIDNO: 20或者图3所示的第28-559位氨基酸，S卩，仍然包括对应于EP1223220图3中的前27个 氨基酸的信号序列。因此，本申请中所述的第317和496位分别对应于EP1223220的SEQ IDNO: 20中所示的第344和523位。
[0009] 此外，已开发了新的方法，其中立体选择性氢氰化在15°C左右的温度下和 2. 5-3. 0左右的pH下进行，特别是2. 5左右和3. 0左右之间的pH循环（cycling)，其中可 行的pH值为2.6、2.7、2.8、2.9、3. 0。优选地，这些条件结合缓慢的底物添加，即连续或半 连续地（即经至少3个不同的长1小时的添加时段向反应混合物供给底物（例如，丁间醇 醛））添加底物。因此，在一个实施方式中，底物的总量并不是在一次快速加入中提供，而是 分批提供，例如，如实施例中所述经1小时加入30_〇1底物，进行共3X次。底物添加与所 添加酶的量有关，其中特别地以这样的速率连续或半连续地添加底物，即所述速率与所使 用的酶成比例并使得其单体形式随着被添加而转化且不积累。本领域技术人员知道，特别 是在阅读实施例之后，如何选择供料速度以避免自发的非酶催化的背景反应。利用所述新 方法，能够提高转化率以及对映体过量。
[0010] 特别地，本发明涉及突变的R-HNL，其在对应于根据SEQIDN0 :1的相应序列中第 317和496位氨基酸残基的位置处包含一个或多个氨基酸替换。
[0011] 对应于SEQIDNO: 1所示第317位残基的位置上的一个优选的氨基酸替换是缬氨 酸被丙氨酸替换（V317A)。W0 2008/071695中更详细描述了包含所述氨基酸替换的来源于 Prunusamygdalus的重组R-HNL，即PaHNL5_V317A。
[0012] 特别地，在对应于SEQIDNO:1中所示的第496位残基的位置上的氨基酸替换是 选自如下的替换：天冬酰胺向丝氨酸（N496S)、天冬酰胺向丙氨酸（N496A)或天冬酰胺向天 冬氨酸（N496D)，其中N496S或N496A是优选的，N496S是最优选的。
[0013] 因此，本发明的重组R-HNL至少包含如下氨基酸替换的组合，S卩，V317A_N496S、 V317A_N496A或V317A_N496D。源自P.amygdalus的根据本发明的重组酶的实例选自： PaHNL5_V317A_N496S、PaHNL5_V317A_N496A和PaHNL5_V317A_N496D。优选地，用于引入本 文所述的氨基酸替换的R-HNL酶来源于Prunusamygdalus，被命名为PaHNL5。来自Prunus amygdalus的成熟PaHNL5的核苷酸序列示于SEQIDNO:1。
[0014] 根据本发明的突变酶可带有其它突变，包括所谓的沉默突变。所述沉默突变的一 个实例是，对应于编码根据SEQIDNO:1的酶的相应多核苷酸序列中的G759A的位置上的 核苷酸改变。
[0015] 术语"羟基腈裂解酶"、"HNL"、"HNL5 "或"酶"在本文中可交换使用。本文所用的 具有催化底物的立体选择性转化（例如羟基新戊醛朝向相应的（R)-对映体）活性的羟基 腈裂解酶当在本文中使用时可被互换地命名为"R-HNL"。所产生的（R)-氰醇可通过酸催化 的水解被进一步转化为（R)-泛酸内酯。术语"PaHNL5 "表示来源于Prunusamygdalus的 同工酶5。SEQIDNO:1中示出了成熟PaHNL5的氨基酸序列。包含本文所述氨基酸替换的 羟基腈裂解酶被称为"重组的"、"突变的"或者"经修饰的"酶。PaHNL5以及本文公开的突 变酶全部能够将底物例如羟基新戊醛立体选择性地转化为相应的（R)-对映体并因此可被 命名为R-HNL。
[0016] 本文所述的重组羟基腈裂解酶可容易地通过在天然存在的R-HNL中引入一个或 多个突变来获得，所述天然存在的R-HNL例如Rosaceae科的羟基腈裂解酶，特别地是选自 如下的酶：Prunusamygdalus(即PaHNL)、Prunusserotina(即PsHNL)、Prunusavium、 Prunuslaurocerasus、Prunuslyonii、Prunusarmaniaca、Prunuspersica、Prunus domestica(艮PPdHNL)、Prunusmume(艮PPmHNL)、Maluscommunis、Maluspumila或Cydonia oblonga，或者合成的R-HNL，其的实例被描述在EP1223220、EP1566441、W02004/083424 或TO2006/076965中。特别地提及EP1223220的图3,其显示了PaHNL5的氨基酸序列，所 述氨基酸序列包括以粗体标记的信号序列。不携带本文所述一个或多个突变的R-HNL被称 为"未经修饰的"酶。
[0017] 将突变（例如，添加、缺失和/或替换）引入到未经修饰的R-HNL的核苷酸和/ 或氨基酸序列中的方法包括但不限于定点或随机诱变和基于PCR的方法。本领域技术人 员知道如何将突变（特别是氨基酸替换）引入到相应序列中（参见例如，Sambrook等人， MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratoryPress，纽约）。一个特别有用的方 法是所谓的易错聚合酶链式反应（ep-PCR)。这涉及使用具有高固有错误率的DNA聚合酶， 例如来自Stratagene(CA，美国）的Mlltazyme·8'IDNA聚合酶或Mutazyme*ΠDNA聚 合酶，或者涉及以使得错误率增加的方式来设计所述聚合酶链式反应的条件。二价阳离子 添加、核苷酸不平衡、pH变化或这些选项中两种或三种的组合导致DNA聚合酶（例如来自 Qiagen、Fermentas等的TaqDNA聚合酶或来自Fermentas的热启动TaqDNA聚合酶或来 自Qiagen等的HotStarTaqDNA聚合酶）的PCR反应混合物的合适改变，从而在基因扩增 期间以可控的率引入错误。W0 2008/071695中更详细地描述了该方法。
[0018] 基于例如使用苯乙醇腈作为底物的活性试验，通过印-PCR获得的文库可被用来 筛选在低pH下提高的稳定性，在所述活性试验中R-HNL酶活性是通过利用HNL-催化的外 消旋苯乙醇腈分解后形成的UV-活性苯甲醛来测量的。吸收测量可在280nm(苯甲醛的消 光系数ε=1.376Lmmoljcm-1)处进行2-5分钟。1单位（AMU)对应于：在pH5.0和室温 下，每分钟将1μmol苯乙醇腈转化为苯甲醛和HCN的HNL酶的量。本领域技术人员已知测 量酶活性的所述和其它方法。
[0019] 羟基新戊醛朝向相应（R)-氰醇的立体选择性转化可通过气相色谱来监测，其中 在整个反应进程中以规律的时间间隔（例如，t= 5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、 4小时和20小时）取出样品。通过迅速加入到.304在二氯甲烷中的冰冷悬浮物中并在冰 水浴中搅拌15分钟来干燥反应等分试样（aliquot)。然后通过用Ac20和吡啶（包含作为 内标的C15烷烃）处理来乙酰化混合物。通过悬浮/倾析来进一步处理混合物，过滤并在 真空中在20°C下浓缩。用在吡啶中的乙酸酐衍生化之后，基于对真实样品相对于作为内标 (ISTD)的十五烷建立的响应因子，通过气相色谱来测定产物产率。每个GC运行持续53. 5 分钟并测量丁间醇醛单体（3. 99分钟）、R-氰醇（14. 57分钟）、S-氰醇（14. 93分钟）、甘油 (16. 52 分钟）、ISTD(20. 85 分钟）、非对映二聚体离析物IR/S(31. 96 分钟）、IIR/S(32. 62 分钟）、IIS/R(32. 88分钟）和IS/R(33. 15分钟）的保留时间。这仅仅是合适方法的一 个实例，其它方法在本领域中已知或者在实施例中被更详细地描述。
[0020] 重组酶的表达在异源或分泌性表达体系中进行，其中优选的宿主（微）生物选 自Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、Aspergillus niger、Penicil