基于3-羟基色原酮结构的Raf激酶抑制剂及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类3-羟基色原酮类化合物、它们的制备方 法、含些化合物的药用组合物以及它们的医疗用途，特别是作为Raf激酶抑制剂以及肿瘤 抑制的用途。
【背景技术】
[0002] Raf激酶已成为一个治疗肿瘤的重要的药物作用靶点。Ras/Raf/MEK/ERK信号转 导通路在细胞信号转导中处于中枢地位，其作为抗肿瘤的靶点在基础研究与药物开发方 面受到了广泛关注，为肿瘤的靶向治疗提供了令人可喜的前景。Raf激酶作为Ras的下游 效应器在此通路中起到关键性作用，突变的Raf激酶能使ERK通路持续激活，并最终导致 诸多生理功能，如细胞增殖、分化、血管生成、凋亡抑制以及肿瘤的发生。2005年，由Onyx Pharmaceuticals(Emeryville,CA,USA)与Bayer(Leverkusen,Germany)公司合作石开发的 Raf-1抑制剂Sorafenib(BAY43-9006)已被FDA批准上市，用于治疗晚期肾癌；2007年FDA 又批准其用于治疗肝癌。Sorafenib是一种双芳基脲类化合物，能强效抑制Raf-1激酶从 而阻断Ras/Raf/MAPK/ERK信号转导通路，临床数据显示Sorafenib对肾癌、前列腺癌，直肠 癌，小细胞和非小细胞肺癌等肿瘤疾病都具有较好的治疗作用。2011年至今，美国FDA又已 批准2个选择性B-Raf激酶抑制剂上市：Vemurafenib和Dabrafenib。这两个抑制剂的成 功上市，进一步增强了这类化合物抑制肿瘤的临床效果和研究价值。
【发明内容】
[0003] 本发明研究了Vemurafenib与Raf激酶的结合模式，并结合AUT0D0CK3. 05对接软 件的计算结果以及药物设计基本原理（如拼合、生物电子等排），对Vemurafenib进行结构 改造，设计了结构新颖，预测活性较好的系列目标化合物。计算机计算结果和初步药理实验 结果表明所设计的化合物与先导化合物有相似的作用机理，可能保留Vemurafenib对革巴的 作用。活性水平超过或近似Vemurafenib或Sorafenib。通过这些工作，期望得到选择性 强，药效好，毒副作用小的先导化合物。
[0004] 本发明的化合物通式A如下：
[0005]
[0006] 其中&、1?2、1?3、1?4、1?5、1? 7、馬、1?9各自独立的表示氢、羟基、硝基、氨基、甲基、乙基、甲 氧基、三氟甲基、卤素、氰基；
[0007] R6表示1-5个碳原子的烷基、环烷基、五元芳杂环、六元芳杂环、苯基或取代苯基；
[0008]X!表示-CH2_、-C0-或-C0NH-;
[0009]X2 表不 _C0_、_C0NH_ 或 _S02_。
[0010] 上述通式的化合物及其药学上可接受的盐可以是：
[0011] 1(4-氟-3-((3-羟基-4-氧-4!1-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰胺出1)，
[0012] ^(4-氟-3-((7-氯-3-羟基-4-氧-纽-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰 胺（B2)，
[0013] ^(4-氟-3-((7-氟-3-羟基-4-氧-纽-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰 胺（B3)，
[0014]N- (4-氟-3- ((6-溴-3-羟基-4-氧-4H-色原酮）甲氨基）苯基）丙烷-1-磺酰 胺（B4)。
[0015] 本发明的部分化合物制备方法如下：
[0016]
[0017] 本发明化合物都可以用上述的制备方法制备得到，根据取代基的不同和取代基位 置的不同选用相应的原料即可。
[0018] 药理测试结果表明，本发明化合物具有Raf激酶抑制活性，可用于预防或治疗与 Raf激酶抑制剂有关的临床疾病，这些疾病可以是：黑色素瘤、肝癌、肾癌、急性白血病、非 小细胞肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、骨髓增生 异常综合症、食管癌、胃癌或间皮瘤等。
[0019] 药理活性测试：
[0020] -、BRafV6°°E激酶活性测试材料和方法
[0021] 完整的B_RafV6°°E 激酶活性试验是由ReactionBiologyCorp.(MalvernPA)公 司通过HotSpotSM激酶法测试。5nMGST标记的人类B-RafV600E蛋白（AA416-766) (Invitrogen，Cat#PV3849)和 20μΜ底物His6 标记的完整人类MEK1 (K97R)(Reaction BiologyCorp.)在缓冲液中（20mMΗ印espH7.5，10mMMgC12，lmMEGTA，0.02%Brij35， 0. 02mg/mlBSA，0.ImMNa3V04,2mMDTT，1%DMS0)室温下混合，然后化合物溶解于指 示剂量的100 %DMS0中（从30μΜ不断稀释3倍）并通过Acoustic技术（Echo550; nanoliterrange)递送到激酶反应的混合液中，接着室温下保持20min。25°C下加入 10μΜ33Ρ-γ-ATP(specifcactivitylOμCi/μ1)(P-ERKinElmer,NEG302H001MC),反 应开始，监测反应120min。激酶活性通过filter-binding法测定，IC50值和曲线拟合由 Prism(GraphPadSoftware)实现。
[0022] 二、细胞活性测试的材料和方法
[0023] 1、材料和仪器
[0024] 311型气套二氧化碳培养箱：购自ThermoFisherScientific公司；
[0025] Vortex-2 润旋振荡器：购自ScientificIndustries公司；
[0026]BSA124S分析天平：北京多利斯天平有限公司；
[0027]BSC-1000IIA2生物安全柜：购自上海博迅实业有限公司；
[0028]CKX41倒置显微镜：购自0LYPUS公司；
[0029] YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌锅：购自上海博迅实业有限公司；
[0030] EasypureII实验试剂超纯水仪：购自ThermoFisherScientific公司；
[0031] DioFugePRIM0型台式高速离心机：购自ThermoFisherScientific公司；
[0032] SpectraMaxPlus384 酶标仪：购自MolecularDevices公司；
[0033] ED(V. 2)水浴锅：购自Julobo公司。
[0034] 2、实验步骤
[0035] 体外细胞培养
[0036]U20S细胞经常规复苏后置于培养箱中在37°C，5%C02及饱和湿度条件下培养，待 细胞生长至指数生长期时，吸除瓶内旧培养液，用PBS洗2次，去除残留培养液，再向瓶内 加入适量消化液（0. 25%胰蛋白酶），使消化液浸没所有细胞表面，置37°C培养箱中孵育。 时间视不同细胞而定，置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含 10%四季青胎牛血清的完全培养液终止消化，离心（1000X，5min)后去除上清液，用培养液 重悬细胞后计数，以细胞数3xl05~5X105cells/mL接种在新的培养瓶内，置于培养箱中以 上述培养条件培养，2~3d传代一次。
[0037]MTT法检测细胞活力
[0038]细胞生长至指数生长期时，以0. 25%胰蛋白酶消化，1000X离心5min，细胞沉淀用 完全培养基调U20S细胞数为0. 8xl05~lxl05cells/mL，在96孔培养板每孔接种100μL， 37°C，5%C02及饱和湿度条件下培养24h后，弃上清；加入含不同浓度的测试化合物或者阳 性药阿霉素的完全培养基200μL，每浓度设6个复孔，对照孔加入含等量DMS0的培养基，继 续培养24h;再加入20μL浓度为5mg/mL的ΜΤΤ，置于C02培养箱37°C孵育；4h后弃去培养 液，每孔加入150μLDMS0,在培养板平台振荡机上振荡10min，置酶标仪中以570nm为检测 波长，630nm为参比波长测定各孔的0D值，计算各给药浓度的抑制率，实验重复3次，测试 化合物对U20S细胞株的IC5。用GraphPadPrism5软件按机率单位加权回归法（Bliss法） 计算。
[0039] 抑制率的计算公式：
[0040] 抑制率（％ ) =(1-加药孔平均0D值）/对照孔平均0D值xlOO%数据统计
[0041] 多组均数间的比较采用单因素方差分析（ONE-WAYAN0VA)，满足方差齐性要求的 数据采用Turkey法进行各组均数的多重比较，否则采用Dunnett'sC验证结果；两组间用 t检验检测显著性。统计学分析结果p< 0. 05认为有显著性差异，p< 0. 01认为有极显著 性差异。
[0042] 药理测试结果
[0043]
【具体实施方式】：
[0044] 实施例1
[0045] 1- (5-溴-2-羟基苯基）-3- (4-吡啶基）丙烷-1，3-二酮（Ml)
[0046] 在100mL三颈瓶中加入30mL四氢呋喃（无水处理），将NaHL2g(49mmol)投入反应 液中，将反应瓶置入冰浴中，控制反应瓶中温度1_5°C。加入异烟酸乙酯562mg(3. 72mmol)。 用15mLTHF将L7g(12. 25mmol)2-羟基-5-溴苯乙酮200mg(0. 93mmol)稀释，使用恒压滴 液漏斗逐滴滴加入反应液，控制反应瓶中温度在1_5°C。搅拌3h后用TLC板检测反应，原料 消失，停止反应。将反应液泼入冰水中，用稀盐酸调节pH至6-7,有大量黄色固体析出，抽 滤，得粗品223mg，产率：75%。直接投下一步。
[0047] 实施例2
[0048] 6-溴-2- (4-吡啶基）-4H-色原酮-4-酮（M2)
[0049] 将Ml100mg，0. 31mmol加入50mL茄形瓶中，加入10mL冰醋酸，滴入1滴稀盐 酸，反应瓶置于油浴，油浴升温至90°C，反应2h。用TLC板检测反应，原料消失，停止反 应。将反应液倒入冰水中，用饱和NaOH溶液调节pH至8-9,有白色固体析出，抽滤得粗 品。粗品经柱层析分离（乙酸乙酯：石油醚=1 : 2)得产物75mg，产率78%。MS[M+H]+ : SOS.iH-NMRDMSO-cUS8.82(d，2H，J= 6. 12Hz，pyridine-H)，8. 14(d，lH，J= 2·43Ηζ， Ar-H) ,8. 08(d,2H,J= 6. 21Hz,pyridine-H), 8. 03 (d, 1H,J= 2. 49Hz,Ar-H), 7. 84 (d, 1H, J= 8. 91Hz,Ar-H) ,7. 34 (s, 1H).
[0050] 实施例3
[0051]N- (4-氟-3-硝基苯）丙烷-1-磺酰胺（M3)
[0052] 将2g3-硝基-4-氟苯胺（12.8mmol)放入250mL三颈瓶中，加入60mL二氯甲烷 (无水处理），加入3. 89g三乙胺（38. 4mmol)，将反应瓶放入冰盐浴中，使得反应液温度 在-5-0°C之间。将3. 83g丙磺酰氯（26. 9mmol)溶于20mL二氯甲烷中，使用恒压滴液漏斗 逐滴加入反应液，控制反应液温度不高于〇°C。待丙磺酰氯全部加入反应液中，撤掉冰盐浴， 常温搅拌lh。TLC监测反应，原料消失，停止反应。将反应液倒入150mL冰水中，用二氯甲 烷萃取3次（20mL*3)，合并有机层，减压蒸出溶剂。将固体放入100mL单颈瓶中，加入40mL 四氢呋喃，加入1. 3g氢氧化锂，加入5mL蒸馏水，常温搅拌1. 5h。TLC监测反应，原料消失， 停止反应。将反应液倒入100mL冰水中，用二氯甲烷萃取3次（25mL*3)，合并有机层，减 压蒸出溶剂。粗