LDV修饰的β-咔啉，其制备，纳米结构，活性和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val。涉及它的制备方法，涉及它的纳米结构，涉及它的体内外抗肿瘤作用，涉 及它抗肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移的作用，进一步涉及它的抗炎和抗栓作用。因而本发明涉 及它在制备抗肿瘤药物，制备抗肿瘤细胞迁移、粘附和侵袭药物，制备抗炎症药物和制备抗 血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。 技术背景
[0002] 恶性肿瘤严重威胁人类的健康。除了自身对肿瘤患者的预后恶劣之外，恶性肿瘤 并发的炎症、血栓和转移进一步恶化患者的预后。例如，超过90%以上的恶性肿瘤患者都是 死于肿瘤转移。肿瘤转移依赖于4个因素：1)肿瘤细胞表面形成微血栓，逃避巨噬细胞吞 噬，通过血液循环迁移到远端；2)迁移到远端的肿瘤细胞粘附到血管壁；3)细胞粘附到血 管壁的肿瘤细胞通过侵袭出血管而进入正常组织；4)炎症使进入正常组织的肿瘤细胞成 长为转移的新生肿瘤。
[0003] 由于现有抗肿瘤药物不具备抗炎症、抗血栓和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭作用， 所以疗效不理想。发明同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤细胞迁移粘附和侵袭的药 物是临床的迫切需求。
[0004] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素 α ν β 3的阻断剂，具有抗血栓和抗细胞 粘附活性。Leu-Asp-Val (LDV)则能特异性作用于整合素 α 4β i，申请人发现在浓度为1 μ Μ 时它可以抑制肿瘤细胞粘附和浸润。申请人曾经把它们与雌激素偶联，制备没有凝血副作 用的抗骨质疏松剂。申请人曾经把它们与四氢_β -咔啉-3-羧酸偶联制备高效的抗血栓 剂。申请人也曾经用氨基酸修饰四氢-β -咔啉-3-羧酸、β -咔啉-3-羧酸及1-位取代的 β -咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氢-β -咔啉-3-羧酸或1-位取代的β -咔啉-3-羧 酸制备高效的抗血栓剂或抗肿瘤剂。下面是发明人创造的结构类型的代表。尽管发明人付 出了大量研究精力，筛选了数百种化合物，一直没有得到同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓 和抗肿瘤转移作用的化合物。
[0005] 发明人在分析数百种化合物的结构及活性变化的基础上，认识到将Leu-Asp-Val 与1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-羧酸偶联，形成的1-(4-羟基-3-甲氧羰 基苯基）-β -咔啉-3-甲酰-Leu-Asp-Val会同时具有抗肿瘤、抗炎症、抗血栓和抗肿瘤细 胞迁移粘附和侵袭作用。基于这个认识，发明人提出了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个内容是提供下面结构的1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔 啉-3-甲醜-Leu-Asp-Val。
[0007]
[0008] 本发明的第二个内容是提供1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β_咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val的制备方法，该方法包括：
[0009] (1)在浓硫酸存在下，5-甲酰水杨酸在甲醇中微波90°C反应2h，生成5-甲酰水杨 酸甲酯；
[0010] (2)在多聚磷酸的存在下，L-色氨酸和苯甲醇反应，生成L-色氨酸苄酯；
[0011] (3)在三氟醋酸存在下，在二氯甲烷中5-甲酰水杨酸和L-色氨酸苄酯缩合为 1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
[0012] (4)在2, 3-二氯-5, 6-二腈基-1，4-苯醌（DDQ)的存在下，1-(4-羟基-3-甲氧 羰基苯基）-1，2,3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃（THF)中氧化为1-(4-羟 基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-羧酸苄酯；
[0013] (5)在Pd/C和Η2存在下，在甲醇中1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-羧 酸苄酯反应生成1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-羧酸；
[0014] (6)采用逐步缩合法，在DCC和HOBt存在下，在干燥THF中反应，得到全保护多肽 序列13〇。-1^11-厶8卩（01^1)-\%1-01^1;
[0015] (7)在冰浴下氯化氢的乙酸乙酯溶液（4M)中，全保护多肽序列 Boc-Leu_Asp(OBzl)-Val-〇Bzl 脱除 Boc 得到 Leu-Asp (OBzl)-Val-OBzl ;
[0016] (8)在DCC和HOBt存在下，1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-羧酸在 无水THF中与Leu-Asp (ΟΒζ 1) -Val-〇Bz 1缩合为1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔 啉-3-甲醜-Leu_Asp(OBzl)-Val-〇Bzl ;
[0017] (9)在Pd/C和H2存在下，在甲醇中化合物1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔 啉-3-甲酰-Leu-Asp (OBzl) -Val-〇Bzl反应得到化合物1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯 基）-β -咔啉-3-甲酰-Leu-Asp-Val。
[0018] 本发明的第三个内容是测定1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val的纳米结构。
[0019] 本发明的第四个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val体外抑制肿瘤细胞增殖的作用。
[0020] 本发明的第五个内容是评价化合物1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔 啉-3-甲酰-LDV对荷sl80小鼠肿瘤生长的抑制作用。
[0021] 本发明的第六个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val体外抑制肿瘤细胞粘附、侵袭和迁移的作用。
[0022] 本发明的第七个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val体内抗炎作用。
[0023] 本发明的第八个内容是评价1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β-咔啉-3-甲 酰-Leu-Asp-Val的体外抗血小板聚集和体内抗血栓作用。
【附图说明】
[0024] 图1.发明人创造的抗血栓或抗肿瘤活性化合物的结构类型代表，式中AA为L-氨 基酸或甘氨酸。
[0025] 图2.化合物5的合成路线· i)CH30H，浓H2S04，微波90°C ;ii)多聚磷酸，苯甲醇， 油浴 75°C ;iii)CH2Cl2, TFA ;iv)THF，DDQ ;v)CH30H，Pd/C，H2 ;vi)DCC，HOBt，NMM，THF ;vii) 氯化氢/乙酸乙酯溶液（4M)。
[0026] 图3.化合物5在纯水溶液中1 X 10 7M浓度下的透射电镜照片。
[0027] 图4.化合物5作用于肿瘤细胞的细胞活力图（η = 3)。
【具体实施方式】
[0028] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0029] 实施例1制备5-甲酰水杨酸甲酯
[0030] 称取1. 660g(10. 0mmol)5_甲酰水杨酸于微波反应罐中，加入25mL甲醇及lmL浓 H2S04，于微波反应器中90°C反应2h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降至室温后， 将反应液转移至lOOmL茄形瓶中，用浓氨水调pH值至7-8,将反应液减压浓缩至干后，加大 量乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯层依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍，然后用无水Na2S0 4干 燥2h，过滤、减压浓缩至干，于室温放置过夜即有晶体析出，得1.635g(90.8% )目标化合 物，为淡黄色针状晶体。ESI-MS(m/e) :181[M+H]+。
[0031] 实施例2制备L-色氨酸苄酯
[0032] 称取15. 0g(44. 4mmol)多聚磷酸于500mL爺形瓶中，加入80mL苯甲醇，使其在油 浴50°C中溶解，待溶液温度上升至75°C后，称取10g (49. Ommol) L-色氨酸加入其中，75°C下 反应48h，利用TLC监测至原料斑点消失，停止反应降温后，在冰浴搅拌下往反应瓶中倒入 400mL无水乙醚，此时有白色固体析出，搅拌过夜后将之过滤，白色固体用200mL乙酸乙酯 和10mL水悬浮，用三乙胺调溶液pH值至8左右，溶液变为澄清状，静置分液，将分离的酯层 依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍，乙酸乙酯层用无水Na2S04干燥2h，过滤、减压浓缩 至干，得12.85g(89.2%)目标化合物，为白色固体。ESI-MS(m/e) :295[M+H] +。
[0033] 实施例3制备1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2, 3, 4-四氢-β -咔啉-3-羧酸 节酯（1)
[0034] 往250mL茄形瓶中加入100mL CH2C12及lOmLTFA，搅拌均匀后称取 11. 76g(40. 0mmol)L-色氨酸节酯和7. 92g(44. 0mmol)5-甲酰水杨酸甲酯加入其中，数分 钟后反应液变为微红色，2天后反应液变为黑色，在冰浴搅拌下缓慢滴加浓氨水将反应液 调pH值至8,将反应液静置分液，将分离CH2C12层依次用饱和NaHC03、饱和NaCl各洗三遍， CH2C12层用无水Na2S04干燥2h，过滤、减压浓缩至干，得14. 59g (80% )目标化合物，为黄色 固体。ESI-MS(m/e) :457[M+H]+。
[0035] 实施例4制备1- (4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-β -咔啉-3-羧酸苄酯（2)
[0036] 称取1-(4-羟基-3-甲氧羰基苯基）-1，2,3,4_四氢-β-咔啉-3-羧酸苄 酯 4. 56g (10.0 mmol)于 250mL 茄形瓶中，用干燥 THF 溶解，加入 DDQ4. 54g (20.0 mmol)， 数分钟后反应液变浑浊，4h后反应完全，过滤，滤出固体依次用饱和NaHC03、甲醇、乙醚 洗，过滤，得3. 75g(82. 7%)目标化合物，为灰白色固体。ESI-MS(m/e) :453[M+H]+;Mp: 190.4-191.0 °C . NMR(300MHz, DMSO) ： δ/ppm = 8. 87 (s, 1H), 8. 42 (m, 2H), 8. 10 (dd, J =2. 1Hz, J = 2. 1Hz, 1H) ,7. 69 (d, J = 8. 1Hz, 1H), 7. 57 (m, 3H), 7. 37 (m, 3H), 7. 04 (d, J = 6. 3Hz)，5. 46(s，1H)，3. 88(s，3H). 13CNMR(75MHz，DMS0) : δ /ppm= 169. 28,165. 93,142. 35， 137. 07,135. 13,131. 75,129. 3