一种临床级胎盘间充质干细胞制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体地，本发明提供了临床级胎盘间充质干细胞 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC)是一类组织来源广泛，包括骨 髓、脂肪组织、乳牙组织、外周血等及新生儿脐带血、脐带、胎盘组织等具有多向分化潜能及 很强自我更新能力的成体组织干细胞，在体内外可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、 肌细胞、肌腱细胞及肝细胞或神经胶质细胞，分泌多能细胞因子及改善微环境及较低的免 疫原性；基于以上特点，使其在发现后迅速成为在细胞治疗、再生医学领域实用型"种子细 胞"。
[0003] 胎盘组织来源干细胞具有典型的间充质干细胞特性，包括良好的自我更新、多向 分化潜能、免疫原性低等特点；并且组织取材方便、无创、无伦理限制且利用率高，是临床级 间充质干细胞良好的组织来源类型。
[0004] 目前胎盘间充质干细胞分离方法主要包括：灌流法、组织贴壁法和酶消化法。
[0005] 灌流法需要多次大量冲洗，工艺繁琐、试剂消耗多且不易冲洗彻底，易造成污染等 弊端难以在产业化生产中应用。
[0006] 组织贴壁法由于原代细胞扩繁周期较长，短期内难以获得大量的细胞数量。
[0007] 酶消化法则包括单一酶类或组合酶类顺序消化等方式。然而，酶消化法酶类选择 众多，消化步骤繁琐、并且酶消化对于细胞增殖能力和细胞活性影响较大。此外，消化后组 织一般要经过滤网过滤后，才能获得单细胞悬液，并且大量的红细胞参杂其中，一定程度上 影响了细胞贴壁生长及增长了原代培养的周期。
[0008] 此外，对于胎盘间充质干细胞的体外扩增环节，目前多数还是使用含低浓度人源 或其他动物源血清培养体系，血清成分的复杂与不明确性限制其用于临床级细胞扩增培 养。
[0009] 也有人尝试在细胞传代扩增阶段添加 bFGF等多种细胞因子替换血清成分，并将 细胞培养皿进行各种基质蛋白胶体，如Matrigel、明胶等特殊包被处理，进行无血清扩增培 养，细胞虽然能够生长，但细胞状态不均一、操作复杂、包被环节成本较高、培养扩增效果批 次稳定性难以控制，并不适合于大规模的制备生产。
[0010] 综上所述，本领域迫切需要开发一种胎盘间充质干细胞高效、低成本且易于通量 程序化操作的分离方法，以便于细胞产业化。
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的在于提供一种对于人胎盘间充质干细胞的高效、简便且易于高 通量产业化制备的临床级胎盘间充质干细胞的制备方法。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种用所述方法制备的胎盘间充质干细胞，所得的胎 盘间充质干细胞具有良好的细胞增殖能力、纯度分析达国际标准并具有良好的成骨、成脂 和软骨分化潜能，且在多次传代后，仍能保持正常的核型。
[0013] 在本发明的第一方面，提供了一种临床级胎盘间充质干细胞的制备方法，所述方 法包括步骤：
[0014] (a)对获得的含间充质干细胞的胎盘组织材料，进行剪碎处理，从而经剪碎的胎盘 组织材料；
[0015] (b)对上一步骤获得的经剪碎的胎盘组织材料，用组合消化酶进行消化，从而获得 经消化的组织混合物，其中所述的组合消化酶包括胶原酶IV和胰蛋白酶；
[0016] (c)从所述经消化的组织混合物中，取上清悬浮液；
[0017] (d)对上一步骤的所述上清悬浮液进行离心，获得沉淀；
[0018] (e)对上一步骤的所述沉淀，加入红细胞裂解液，从而获得经红细胞裂解处理的混 合物；
[0019] (f)对上一步骤的所述经红细胞裂解处理的混合物，进行离心，获得沉淀，即为原 代间充质干细胞；
[0020] (g)对上一步骤的所述原代间充质干细胞进行无血清扩增传代，从而经传代的临 床级胎盘间充质干细胞。
[0021] 在另一优选例中，所述的胎盘组织材料经病毒检测为阴性。
[0022] 在另一优选例中，所述的病毒检测包括（但不限于）检测以下一种或多种传染性 病毒：乙肝病毒、丙肝病毒、HIV病毒、梅毒、巨细胞病毒等。
[0023] 在另一优选例中，在步骤（a)，经剪碎的胎盘组织材料，其体积大小为0.2_2ml，一 般0. 5ml左右（一般可置于例如15ml的离心管中）。
[0024] 在另一优选例中，在步骤（b)中，所述的消化酶包括终浓度（工作浓度）为50U/ ml-100U/ml胶原酶IV和0· 005wt % -0· Olwt %胰蛋白酶；较佳地80U/ml胶原酶IV和 0. 008wt %。
[0025] 在另一优选例中，在步骤（b)中，所述消化酶以含胶原酶IV和胰蛋白酶的组合消 化酶液的方式加入含所述的经剪碎的胎盘组织材料的容器中（例如15ml离心管）。
[0026] 在另一优选例中，在步骤（b)中，消化条件包括：在37±2°C下进行消化；消化 6-24小时，较佳地消化8-20小时，更佳地消化12-18小时，优选16h。
[0027] 在另一优选例中，在步骤（b)中，胶原酶IV和胰蛋白酶可依次、先后、或同时加入； 优选地，同时加入。
[0028] 在另一优选例中，所述的胎盘组织材料包括胎盘羊膜组织、胎盘绒毛膜组织或其 组合。
[0029] 在另一优选例中，在步骤（c)中包括：对所述经消化的组织混合物进行静置处理 (约30秒-3分钟，优选45秒），然后取上清悬浮液。
[0030] 在步骤（d)中，所述的离心的条件为300_500g，离心时间为1-10分钟。
[0031] 在步骤（e)中，所述的红细胞裂解处理的条件为37±2°C，处理1-10分钟。
[0032] 在另一优选例中，在步骤（e)中，在红细胞裂解处理后，加入l-10ml 1 %青霉素/ 链霉素 PBS液，进行混匀后，从而获得经红细胞裂解处理的混合物。
[0033] 在另一优选例中，在步骤（f)中，所述的离心的条件为300_500g，离心时间为1-10 分钟。
[0034] 在另一优选例中，在步骤（g)中，所述传代的次数为1-10次，较佳地1-5次。
[0035] 在另一优选例中，在步骤（g)中，所述的传代在无血清培养基中进行。
[0036] 在另一优选例中，所述的无血清培养基包括Corning? stemgro? hMSC培养基， 无动物异源成分、化学成分明确、批次稳定的培养基，或其它无血清培养基。
[0037] 在另一优选例中，所述的临床级胎盘间充质干细胞制备符合以下标准：
[0038] (i)使用无血清、无异源动物成分及化学成分明确的细胞培养传代体系；
[0039] (ii)细胞表面标志物 CD73、CD90、CD105>95% 以上，CD34、CD45〈2% ;
[0040] (iii)具有成骨、成脂和软骨分化潜能；和
[0041] (iv)体外多次传代操作后，具有正常的人核型。
[0042] 在另一优选例中，在步骤（g)中，在传代培养时当间充质干细胞生长到80-90 %融 合度时，去除培养液，对所述间充质干细胞进行清洗，然后加入胰蛋白酶对所述间充质干细 胞进行处理，从而获得经胰蛋白酶消化处理的间充质干细胞，用于后续传代培养。
[0043] 在本发明的第二方面，提供了一种分离的临床级胎盘间充质干细胞群，所述的干 细胞群是用本发明第一方面所述方法制备的。
[0044] 在另一优选例中，所述的间充质干细胞群为1-3代的间充质干细胞。
[0045] 在另一优选例中，所述的间充质干细胞群具有以下特征：
[0046] (a)彡95% (较佳地彡97% )的细胞具有表面抗原CD73 ;
[0047] (b)彡95% (较佳地彡97% )的细胞具有表面抗原CD90 ;和
[0048] (c)彡95% (较佳地彡97% )的细胞具有表面抗原CD105。
[0049] 在另一优选例中，所述胎盘间充质干细胞为人胎盘间充质干细胞。
[0050] 在另一优选例中，所述的干细胞群还具有以下特征：
[0051] (d)彡2% (较佳地彡1% )细胞具有表面抗原CD34 ;
[0052] (e)彡2% (较佳地彡1% )细胞具有表面抗原⑶45。
[0053] 在本发明的第三方面，提供了一种用于制备临床级胎盘间充质干细胞的工作液， 所述的工作液含有组合酶，所述组合酶包括胶原酶IV型和胰蛋白酶，并且
[0054] 所述的胶原酶IV型和胰蛋白酶的工作浓度分别为50-100u/ml和 0. 005-0.0 lwt%。
[0055] 在另一优选例中，胶原酶IV型和胰蛋白酶的工作浓度分别为60-90u/ml (如80U/ ml)和 0· 006-0. 009wt% (如 0· 008wt% )。
[0056] 在另一优选例中，所述的工作液所含的酶由胶原酶IV型和胰蛋白酶构成。
[0057] 在另一优选例中，所述的工作液由体积比为1 一 2:2-1的胶原酶IV型消化液和胰 蛋白酶消化液混合而成。
[0058] 在另一优选例中，所述胶原酶IV型和胰蛋白酶的含量之比为：50-100U胶原酶IV 型：5-10mg的胰蛋白酶。
[0059] 在另一优选例中，所述的工作液以2-4g: