一种含酸性蛋白酶的啤酒复合酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种含酸性蛋白酶的啤酒复合酶及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] 啤酒营养丰富，酒精含量低，以其特有的泡沫和特殊的香味，深受广大消费者喜 爱，啤酒中含有人体必须的维生素、氨基酸和碳水化合物等营养物质，适量的饮用啤酒有利 于人体健康，故享有"液体面包"的美名。
[0003] 我国啤酒业发展迅速，啤酒产量已连续几年位居世界首位，但遗憾的是，国产大麦 的发展却出现了徘徊不前的窘况。其根本原因是受土质、气候、品种、发芽方法、工艺条件等 的制约，国产麦芽的品质一直较低。大的啤酒集团不惜高价进口一类澳麦和法麦为啤酒生 产原料，国产大麦由于受诸多因素影响，本身的淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶、氧 化还原酶等在发芽过程中分泌不足，导致啤酒麦芽中β-葡聚糖、半纤维素、蛋白质等含量 过高，造成糖化后麦汁质量和产量双低，不能生产高端啤酒。
[0004] 随着各种啤酒原料价格的不断上涨，特别是进口麦芽、大米价格的直线上扬，直接 导致了啤酒生产成本的大幅上升。为维持企业的生存和发展，各个啤酒厂加都在积极应对 此项问题，通过技术创新和提高辅料比例来消化成本上升的压力，在这种形势下，原料中添 加小麦芽及淀粉质辅料成为啤酒企业的主要选择。
[0005] 在大麦芽质量较差以及添加淀粉质辅料较多的情况时，酶制剂的添加成为一种必 要。目前，酶制剂市场啤酒复合酶种类较多，按照添加工序来分有糖化工序、发酵工序、过滤 工序及灌装工序啤酒复合酶，以糖化工序添加的复合酶较多，其主要的复配原则是以啤酒 麦芽酶系为基础进行淀粉酶、蛋白酶、半纤维素酶、磷酸酯酶、氧化还原酶等酶制剂的优化 组合，成功解决了因为麦芽质量差或辅料添加量高而引起的糖化不完全、浸出率低，麦汁粘 度大、过滤困难，蛋白质溶解不充分、α -氨基氮含量低等麦汁制造难题。
[0006] 但是，当啤酒酿造过程中为了降低生产成本，提高辅料使用比例时，虽然添加外加 酶制剂糖化可有效改善啤酒口味，降低色度、总酚，延长啤酒保质期，但同时也会产生许多 负面影响，如氮源不足、过滤困难、非生物稳定性降低等，造成酿制出的啤酒氨基酸水平低、 营养价值不高，啤酒的泡沫性能差、泡沫不丰富，麦芽香味不足等质量缺陷，失去了传统啤 酒的本质口感和风味，称不上真正意义的啤酒。为此大多数啤酒生产厂家通过添加不同的 食品添加剂试图解决上述质量问题但效果仍不理想。中国专利CN103242996 Β公开了一 种啤酒复合酶及其制备方法，所述啤酒复合酶以天然浓缩麦芽酶为主要原料，科学复配混 合酶，不仅补充了充足的酶源，更重要的是在保护剂和激活剂协同作用下，其酶活力更足、 保存性能更优越、氮源更丰富、麦芽香味更足，常温保存2年酶活损失在3%以下；中国专利 CN103865701A公开了一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶及其制备方法，所述啤酒复合酶中的 中性蛋白酶是由产强热稳定性中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌1398-2-12为出发菌株经特定 发酵条件下的液体深层发酵而制备的，发酵液中性蛋白酶酶活力为5500-7000U/mL ;上述 已经公开的啤酒复合酶虽然在啤酒酿造中发挥了重要的作用，但啤酒复合酶中蛋白酶的酶 活力有待继续提高、蛋白酶酶系不全、啤酒复合酶组分没有添加消除自由基并提高酶活力 的抗氧化剂。啤酒复合酶存在一定的缺陷。
【发明内容】
[0007] 本发明所解决的技术问题是克服了现有啤酒复合酶中蛋白酶酶活力低、酶系不 全，复合酶抗氧化能力低、酶活力损失大等缺陷，以浓缩麦芽酶和浓缩麦汁粉为主要原料， 科学复配高活力酸性蛋白酶等食品级酶制剂、植物提取物、抗氧化剂、保护剂、激活剂等；制 得一种蛋白酶系全、酶活力高、不易失活、麦芽香味浓、可为麦汁提供丰富氮源的啤酒复合 酶。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：
[0009] -种含酸性蛋白酶的啤酒复合酶，由以下重量份数的原料组成：
[0010] 浓缩麦芽酶45-55份，淀粉酶30-40份，蛋白酶20-30份，半纤维素酶15-30份，植 物提取物15-20份，浓缩麦汁粉13-18份，酯酶5-10份，保护剂5-8份，激活剂5-8份，抗氧 化剂1-3份；
[0011] 所述植物提取物中含有蛋白酶、淀粉酶、半纤维素酶、酯酶、氧化还原酶等多种植 物酶；
[0012] 所述植物提取物中还含有植物多糖和单糖、植物淀粉、植物蛋白等营养物质，不仅 可为啤酒复合酶提供全面、丰富的植物酶，还可作为制备酸性蛋白酶的发酵培养基成分，提 高蛋白酶活力和微生物产酶能力；
[0013] 所述植物提取物采用超声清洗、微波辅助超声提取和高压脉冲电场提取、超滤浓 缩等低温提取技术，有效提高了原料利用率、植物酶活性和产率；有效保证了植物提取物的 食品安全性；
[0014] 所述植物提取物的制备方法为：将大麦芽、焦香麦芽按质量比2-3:1-2均匀混合， 粉碎至粒度0. 5-lmm，得粉碎麦芽；然后将木瓜、菠萝、无花果分别于超声波清洗机中在功 率200W、频率30KHz条件下超声清洗5-10min，浙干，室温下破碎至粒度0. 5-lmm，并按质量 比5-7:4-6:1-3均匀混合，加入混合物质量1. 5-3倍的粉碎麦芽得原料混合物，加入原料混 合物1-3倍的水，用柠檬酸调节pH值为3-4,在功率150-300W、频率2000Hz条件下进行微 波提取，其中，每次微波辐照总时间60-SOs，进行间隔式辐照：辐照10s，间隔10s，控制温度 20-35°C，如此辐照10次，同时在功率200-300W，频率30-40KHZ条件下进行超声波辅助提 取；保温l_3h，然后，在功率200-400W、频率2000Hz条件下进行微波提取，其中，每次微波 辐照总时间90-105S，进行间隔式辐照：辐照15s，间隔10s，控制温度40-60°C，如此辐照10 次，同时在功率300-500W，频率40-50KHZ条件下进行超声波辅助提取，最后自然降温至室 温，于电场强度25-35kV/cm，脉冲时间400-600 μ s，脉冲频率200-300HZ条件下进行高压脉 冲电场（PEF)提取15-20min ;提取液过滤得第一滤液，加滤渣2倍的水漂洗、过滤得第二滤 液，将第一滤液和第二滤液按质量比1:1-2均匀混合，混合液超滤浓缩、冷冻干燥、低温粉 碎即得植物提取物；
[0015] 优选地，所述超声波清洗机中清洗液为0. 3-0. 5%的碳酸氢钠溶液。
[0016] 所述蛋白酶是由以下质量百分比组成的酶制剂均匀混合而成：中性蛋白酶50%， 酸性蛋白酶40%，10%脯氨酸蛋白酶；
[0017] 优选地，所述酸性蛋白酶是以高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉（Aspergillus usamil)CCTCC NO :M 2013601为出发菌株，经特定发酵条件下的液体深层发酵而制得，并且 发酵培养基中科学复配了上述制备的植物提取物；
[0018] 优选地，所述酸性蛋白酶的制备方法包括以下步骤：保存完好的宇佐美曲霉CCTCC NO :M 2013601的菌种经斜面菌种活化、一级、二级、三级液体种子扩大培养至种子罐，将 种子罐液体种子以5%接种量接入发酵罐培养基，培养温度31-321：，搅拌速度200-40(^/ m，通风量1:1-2,培养时间10-12h ;然后以1-2°C /h降温速率缓慢降温至26-30°C，搅拌 速度400-600r/m，通风量1:1-3,恒温培养8-10h ;继续以1-2°C /h降温速率缓慢降温至 23-25°C，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,培养时间22-31h，然后，将种子罐液体种 子以3%接种量追加接入发酵罐，最后以1-2°C /h升温速率缓慢升温至31-32°C，搅拌速 度200-400r/m，通风量1:1-2,恒温培养10-12h ;接着以1-2°C /h降温速率缓慢降温至 23-25°C，搅拌速度500-700r/m，通风量1:2-4,恒温培养22-31h ;发酵液经过滤、浓缩、调 配、精滤、干燥得固体酸性蛋白酶；
[0019] 所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g，琼脂20g，中草药提取物5-10g，干酪素4g， 磷酸氢二钾2g，氯化镁0. 6g，氯化钾0. 8g，蒸馏水1000mL，pH值5. 8,121°C灭菌20min。
[0020] 所述一级、二级、三级种子培养基组成为：麸皮60-80g，玉米粉50-60g，豆饼粉 35-40g，海藻糖10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，干酪素5-10g，中草药提 取物5-10g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾l-3g，纯净水1000mL，pH值5-7,121°C灭菌20min ;
[0021] 所述种子罐培养基组成为：麸皮60-80g，玉米粉50-60g，豆饼粉35-40g，海藻糖 10-15g，中草药提取物10-15g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙5-10g，干酪素5-10g，硫 酸镁2-4g，磷酸氢二钾l-3g，纯净水1000mL，pH值5-7,121°C灭菌20min ;
[0022] 所述种子罐发酵液菌体浓度为7. 0xl0s_8. 0x10s个/ml ;
[0023] 所述发酵罐培养基组成为：麸皮60_80g，玉米粉50_60g，植物提取物40_60g，豆 饼粉35-40g，中草药提取物20-30g，海藻糖10-30g，鱼粉6-10g，氯化铵10-12g，氯化钙 5-10g，干酪素3-5g，硫酸镁2-4g，磷酸氢二钾l-3g，硝酸钾l-2g，硫酸锌0. 1-0. 2g，纯净水 1000mL，pH 值 5-7,121°C 灭菌 20min ;
[0024] 所述中草药提取物的制备方法如下：
[0025] 按重量份数计，称取黄芪60-70份，当归55-65份，党参40-45份，甘草40-45份， 鱼腥草35-45份，神曲35-45份，金银花25-35份，柴胡10-15份，黄芩10-15份；将上述中 草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度 70°C _90°C保持2-4h，然后降温至45-60°C，加入混合物料总重量5-10%的混合酶制剂进行 酶解，用乳酸调节pH值为5. 5-6. 8,酶解2-4h，最后添加混合物料0. 5-3倍重量乙醇和丙醇 的混合物，乙醇和丙醇混合的质量比为1:1. 5,控制温度至60°C -78°C保持3-4h，过滤，得第 一滤液；添加滤渣1-3倍重量的水，控制温度85°C _95°C保持l_3h，然后降温至25-35°C，过 滤，得第二滤液；将第一滤液和第二滤液按照质量比2-3:1-2合并，滤液真空浓缩后冷冻干 燥、粉碎即得中草药提取物；
[0026] 所述混合酶为葡聚糖酶、木聚糖酶、戊聚糖酶、果胶酶按质量比4:3:2:1均匀混 合。
[0027] 所述浓缩麦芽酶重量百分比组成为：原麦芽酶60-80%，香味麦芽酶20-40%。
[0028] 所述原麦芽酶制备方法如下：
[0029] (1)高压脉冲电场（PEF)浸泡处理：将麦芽在预浸槽中用3-6倍20-50°C温水浸 泡10-20min，使麦芽水分含量达到25-35%，同时进行高压脉冲电场（PEF)处理，电场强度 20-40kV/cm，脉冲时间 150-200μ s,脉冲频率 200-300HZ ;
[0030] (2)粉碎：将步骤（1)中处理好的麦芽与浸泡水加入麦芽粉碎机带水粉碎，调整辊 间距为0. 5mm,转速为250rpm,得到麦芽楽液；
[0031] (3)超声、PEF提取：将麦芽浆液置于配料缸中，边缓慢搅拌边用探头式超声提 取仪在电流强度〇. 6A/25W-1. 5A/275W条件下进行超声提取10-15min ;然后进行高压脉 冲电场（PEF)提取15-20min，电场强度20-40kV/cm，脉冲时间400-600μ s，脉冲频率 200-300ΗΖ ；
[0032] (4)过滤：将提取液于室温用500-800目滤布预涂粒度为100目-300目硅藻土， 采用板框过滤机进行过滤，操作压力为〇. 14