Mir27a-3p作为前列腺癌分子标志物及其在诊断试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种前列腺癌分子标志物MIR27A - 3P及其 在诊断试剂盒中的应用，包括通过该生物分子标志物在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺 癌的诊断、前列腺癌治疗及状况的监测、前列腺癌指导用药的监测及前列腺癌预后检测等 领域的应用。
【背景技术】
[0002] 根据《ASC0年度报告：2015临床肿瘤学进展》中相关内容，液体活检技术被 列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。血液中的一些分子标志物已经被应用于一些 疾病的诊断，如谷丙转氨酶用于肝炎的诊断，白细胞数目用于判断炎症。血液循环肿瘤 DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)是一种无细胞状态的胞外游离DNA，存在于血液、滑膜 液和脑脊液等体液中，体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，其主要是 由短的单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA 两种形式存在。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，因此，ctDNA是一种特征性的新的肿瘤 生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪，将成为临床肿瘤的早期诊断、预后判定及跟 踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创和分子生物学检测手段，尤其对于一些 不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。 结合新一代测序技术（NGS)将变成"液体活检"，并替代侵入组织性活检。
[0003] MIR27a - 3p属于microRNA，是一类由内源基因编码的微小RNA，不编码蛋白，大 小为20~24个核苷酸，广泛存在于植物、动物和各种病毒中，在RNA沉默和转录后翻译调 控中发挥举足轻重的作用。每个miRNA可以有多个靶基因，每个基因也可能受多个miRNA 调控。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几 个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。 MicroRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性及组织特异性等特点使其优于蛋白质、 DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发 挥日益重要的作用。。
[0004] 前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在 男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害 男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增 长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95%发 生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症 状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增 生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达 晚期，预后不良。
[0005] 前列腺癌的临床诊断方式目前主要有直肠指检、血清前列腺特异性抗原（PSA)检 测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过 医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根 治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：（1)患者 前列腺肿块不大时，易漏诊；（2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治； (3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；（4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。 正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng / ml)，当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病 状态时，PSA升高成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性：（1)需要 取血检测，对患者有一定的损伤；（2) PSA增高也常见与非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前 列腺肥大等，因此不易确诊；（3) PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已经属于中后期，达不 到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简单直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、 位置、密度、边缘、形体、有无钙化及钙化的形态、大小、数目、分布以及周围的晕环、皮肤改 变等提供定位及定性征象并判断病变的性质；其局限性是：（1)对致密性的小癌灶容易漏 诊；（2)有时候不能提供明确的定性诊断；（3)因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所 以诊断符合率很低；（4)对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织 病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与 其他方法技术连用。
[0006] 近年来的研究表明，miRNA与前列腺癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展 和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应 的作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子标志物，以及前 列腺癌诊断试剂盒，以及该前列腺癌分子标志物和前列腺癌诊断试剂盒在前列腺癌高危人 群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。
[0008] 本发明经研究发现MIR27A - 3P在前列腺癌组织样本中的含量比前列腺正常组织 样本中的含量低，显示MIR27A - 3P与前列腺癌的肿瘤发生、发展存在着密切的相关性。因 此，本发明提出MIR27A - 3P作为与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子标志物，并提供含有 该前列腺癌分子标志物MIR27A - 3P (作为标志物）的诊断试剂盒，以及该分子标志物或诊 断试剂盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。
[0009] 本发明提供的前列腺癌分子标志物MIR27A - 3P，是一种miRNA，其核苷酸序列为 SEQ ID NO. 1 所示。
[0010] 本发明提供含有前述前列腺癌分子标志物MIR27A - 3Ρ的诊断试剂盒。该诊断试 剂盒可用于前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测等。
[0011] 前述的前列腺癌分子标志物MIR27A - 3Ρ作为标志物在制备前列腺癌尚危人群筛 选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，是通过检测被试者组织样本、血液和 尿液中的MIR27A - 3Ρ的含量，并与正常水平MIR27A - 3Ρ含量相比较，以进行前列腺癌高 危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。
[0012] 前述的前列腺癌分子标志物MIR27A - 3Ρ作为标志物在制备前列腺癌尚危人群筛 选、诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，可把被试者血 清、尿液和组织样本中MIR27A - 3P的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测。
[0013] 前述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒包括： (1)组织样本、血液和尿液中总RNA提取试剂； 每50mg组织或200ul血液或200ul尿液，使用：
引物包括MIR27A - 3P和对照RNU6两对引物； (4)前列腺正常组织cDNA (miR-27a反转录引物反转录） 作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA 相同量。
[0014] 前述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒结果分析检测样本和阴性对照间比较采用t 检验，P〈0. 05为差异显著，判为标本检测阳性。
[0015] 前述检测试剂盒所用对照为RNU6,其引物序列如下： RNU6 上游引物序列：5 ' -CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3 ' (SEQ ID N0. 2) RNU6 下游引物序列：5 ' -TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3 ' (SEQ ID N0. 3)。
[0016] 前述检测试剂盒所检测MIR27A - 3P，其引物序列如下： MIR27a - 3p 上游引物序列：5 ' -CTAATCGTGTTCACAGTGGCTAAG -3 ' (SEQ ID N0. 4) MIR27a - 3p 下游引物序列：5 ' -TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT -3 ' (SEQ