探针杂交法、位点 特异性PCR法、PCR-dHPLC (变性高效液相色谱)、及PCR-SSCP (单链构象多态性）法。
[0018] 上述方法中得到的PCR产物还能用其他方法进行检测，如DNA杂交探针法。所用 探针能是与突变KatG基因核苷酸序列杂交，也可以有两个探针分别与正常或突变的KatG 基因核苷酸序列杂交。探针能够选择同位素标记、有色物质标记或荧光物质标记。此外，还 能够用位点特异的PCR引物、限制性内切酶或单链构象多态性的方法确定突变。
[0019] 上述方法中使用的PCR引物依据已知的核苷酸序列进行设计，通常长度为18-25 个碱基，GC含量在±45-55%，用引物设计软件Primer5和01ig〇6设计PCR扩增引物，本发 明中设计的PCR扩增引物序列为： 上游引物：5' -CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3' 下游引物：5 ' -GGGGCTGATCTACGTGAAC-3 ' 本发明提供的检查KatG基因 c. 906OA突变的试剂盒，试剂盒内应装有用于检测KatG 基因 c. 906OA突变的试剂，同时提供的是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制 品的制造、使用及销售信息。如采用PCR-直接测序法检测KatG基因 c. 906OA突变的试剂 盒，含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液及测序所需试剂的一种或 多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性成分，如扩增引物为本发明中所述的一对 引物KatG-F和KatG-R，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够进行PCR扩增的酶。
[0020] 本发明的优点在于： 1、试剂盒能够简便、快捷、准确的测定患者KatG基因的突变位点，从而用于耐异烟肼 结核患者的诊断和治疗中。
[0021] 2、能够用于在结核患者中大规模筛查异烟肼耐药率，为诊断结核分枝杆菌患者的 感染菌株是否具有异烟肼耐药性提供服务及参考。
[0022] 3、为耐异烟肼的结核患者进行基因筛查提供准确和简单的方法；并为将来利用这 一突变作为检测靶点针对耐药结核病进行治疗奠定坚实的基础。
【附图说明】
[0023] 图1为结核分枝杆菌KatG基因突变c. 906OA的序列图； 图2为KatG基因 PCR产物电泳检测示意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于 所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用 常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0025] 实施例1:采集检测样本 1、收集到33株耐异烟肼的结核菌株，临床患者均为肺结核患者，经药敏异烟肼（INH 0.1 ug/ml)试验检测结果可知，共获取34株耐异烟肼结核菌株。耐异烟肼患者平均年龄为 38. 6岁。男性患者占比58. 82% (20/34)，年龄介于20~69岁，平均年龄为41. 6岁；女性 患者占比41. 18% (14/34)，年龄介于14~67岁，平均年龄34. 3岁。
[0026] 实施例2:结核分枝杆菌基因组DNA的提取 1、 采用一次性接种环刮取结核菌菌培养菌落置于1.5 ml EP管中（尽量不要刮取到培 养基）； 2、 向菌体沉淀物的离心管中加入500 μ 1细胞悬浮液(先检查是否已加入Lysozyme)， 使用移液器或漩涡振荡器彻底悬浮结核菌细胞沉淀，37°C温浴30 min每隔5-10 min颠倒 混匀数次，12 000 rpm (~13 400 Xg)离心2 min，尽量吸净上清； 3、 向菌体沉淀中加入225 μ 1缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮； 4、 向管中加入10 μ 1蛋白酶Κ溶液，颠倒混匀； 5、 加入25 μ 1裂解缓冲液S，颠倒混匀；57°C水浴放置20 min，其间颠倒混匀数次； 6、 加入250 μ 1缓冲液B，振荡5 s充分混匀； 7、 加250 μ 1无水乙醇，充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去 除管内壁的水珠； 8、 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12 000 rpm (~13 400Xg)离心30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中； 9、 向吸附柱中加入500 μ 1缓冲液C，12 000 rpm (~13 400Xg)离心30 s，倒掉废 液，将吸附柱放入收集管中； 10、 向吸附柱中加入700 μ 1漂洗液W2(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12 000 rpm (~13 400Xg)离心30 s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中； 11、 向吸附柱中加入500 μ 1漂洗液W2,12 000 rpm (~13 400Xg)离心30 s，倒掉废 液，将吸附柱放回收集管中。然后12 000 rpm (~13 400Xg)离心2 min。将吸附柱置于 一个新的1. 5 ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 12、 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加135 μ 1洗脱缓 冲液ΤΕ，室温放置2-5 min，12 000 rpm (~13 400 Xg)离心2 min，将溶液收集到离心管 中，冻于-40°C，待实验研究使用。
[0027] 实施例3:PCR扩增，电泳结果 以提取的结核分枝杆菌全基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增基因为KatG基因，所 用引物 5' -CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3' 和 5' -GGGGCTGATCTACGTGAAC-3'。
[0028] PCR扩增体系：2XPCR预混液25 yL (含rTaq酶，TAKARA)，正反向引物各1 μΜ， 模板DNA 50 ng，加入21 μ L去离子水。
[0029] PCR反应条件为：94度变性5分钟，然后35个循环的（94度变性30秒，50度退火 30秒，72度延伸1分30秒)，最后终末72度延伸7分钟。扩增产物长度为983 bp，然后进 行琼脂糖凝胶电泳检测，选用DL2000型号DNA marker作为PCR扩增产物对照，配制胶浓度 为1. 5%的琼脂糖凝胶，120伏恒压条件下，电泳20-30分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶放入 EB染液中染色5-10分钟，置于紫外灯下观察电泳条带并进行记录，电泳结果见图2。
[0030] 实施例4:测序结果 PCR产物送测序公司进行序列测定，测序引物为5' -CCGCCTTTGCTGCTTTCTC-3'，测序后 经与结核分枝杆菌标准株序列进行对比，发现突变位点c. 906OA，突变序列见序列表，突变 图谱见图1。
【主权项】
1. 一种结核分枝杆菌KatG突变基因，其特征在于：该突变基因具有c. 906OA突变位 点，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。2. 权利要求1所述的结核分枝杆菌KatG突变基因在制备用于检测耐异烟肼结核分枝 杆菌试剂盒中的应用，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌KatG基因c. 906OA突变的 试剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQID NO:1和SEQIDNO:2所示的引物。
【专利摘要】本发明公开了结核分枝杆菌KatG突变基因及其用途<b>，</b>该突变基因与正常KatG基因相比，具有c.906C>A突变位点；本发明用候选基因筛查的方法，对中国33株耐异烟肼结核菌株中进行检测，首次发现该基因突变位点，在耐异烟肼的结核菌株中KatG基因突变c.906C>A具有一定的发生频率，因此Kat基因突变c.906C>A可以作为临床异烟肼耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/53, C12Q1/04, C12R1/32
【公开号】CN105316349
【申请号】CN201510802206
【发明人】张阿梅, 夏雪山, 宋玉竹, 李道群
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月19日