一种利用氧化剂处理微藻高效诱导中性脂快速积累的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微藻生物和生物能源技术领域，更具体涉及一种利用氧化剂处理微藻高效诱导中性脂快速积累的方法，可用于微藻生物能源生产方面。
【背景技术】
[0002]微藻是原核或者真核的单细胞光合微生物，是非常高效的太阳能转换器，分布于淡水或者咸水中，通过吸收水环境传递的光能、水和C02积累生物量，可以将光能转化为化学能，以油脂或淀粉的等有机物的形式储存在细胞内。作为最古老的低等光合生物，某些微藻可直接利用太阳光、C02及含N、P等简单营养物质快速生长并在细胞内合成大量油脂(主要是中性脂甘油三酯)，从而为生物柴油生产提供新的油脂资源。
[0003]最常见的产油微藻，如小球藻、杜氏盐藻、等鞭金藻、微绿球藻、眼点拟微绿球藻、新绿藻、葡萄藻、菱形藻、三角褐指藻和紫球藻等，在适宜条件下培养细胞内的含油量达20-50%。实验表明，小球藻的含油量最高，尤其适合用于生产生物柴油。然而，高含油量通常以低生物量生产力为代价，绝大多数含油量高的藻种生长缓慢，而生长迅速的藻种往往含油量相对较低。有些研究者试图利用基因工程来调整原微藻的特性，来提高藻种的生产率和油脂(特别是中性脂)的产量。然而，目前只有极少产油微藻品种是经过基因修饰的
(如Chlamydomonas reinhardti1-基因组已被完全阐明，淡水藻种)，基因工程在微藻生物柴油中的应用面临着几个挑战:缺乏基因表达调控方面的理论研究；缺少特异的分子生物学工具，如:高效的遗传转化，有效启动子，选择性标记基因，稳定的转基因表达体。尽管应用于微藻基因组序列的生物信息学已经本质上揭示了简单的生化途径，但人们对于明白微藻脂类代谢调节的模式和详细分子通路还很遥远。
[0004]由于利用遗传改造微藻特性，提高微藻油脂含量的研究进展缓慢，许多研究者也在尝试其他几种方式促进微藻中油脂的积累。第一种方式，条件诱导:研究发现许多微藻藻种可以通过条件诱导积累大量的油脂，平均含油量从20%到70%不等，一些藻种的含油量在特定条件下可能达到90%。营养胁迫是最常使用的提高藻类油脂积累的一种高效的条件诱导方式。一般认为，缺少足够的氮或磷的基质来培养微藻细胞生长合成蛋白质时，光合作用产生的多余的碳就会转化为储能分子，如甘油三脂或者淀粉。据Convertiet al.(Converti, A., Casazza, A.A., Ortiz, E.Y., Perego, P.and Del Borghi, M., 2009.Chemical Engineering and Processing:Process Intensificat1n 48:1146-1151) ?艮道，培养基中的NaN03浓度从1.5g/L降到0.375g/L的过程中，油脂含量升高了两倍(从5.9%到 15.3% )。Xin et a 1.(Xin, L., Hu, Η.Y., Ke, G.and Sun, Y.X., 2010.B1resourcetechnologylOl: 5494-5500)研究了磷浓度对淡水微藻Scenedesmus sp.LX1油脂积累的影响，在P(0.lmg/L)胁迫条件下，其油脂积累可以达到总生物量的53%。第二种方式，添加一些特殊成分来诱导。如专利CN102776250A公开了一种在水体中添加特殊成分物提高藻细胞油脂含量的方法，通过添加磷酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、泛酸钠、三氯化铁和生物素等特殊成分物，在最佳化添加特殊成分培养条件下，微藻细胞油脂含量可比无添加特殊成分培养的微藻细胞高62%以上。专利CN103710402A在微藻的培养基中添加丁基羟基茴香醚促进微藻油脂积累。然而，这两种方式虽然都很大程度上促进了微藻中油脂的积累，提高了微藻细胞中油脂的含量，但都存在一些问题。营养胁迫等条件诱导方式处理的微藻往往需要相对较长的时间才能促进微藻油脂的大量积累。例如，Widjaja etal.(Widjaja, A., Chien, C.C.an dju, Y.H., 2009.Journal of the Taiwan Institute ofChemical Engineers40:13-20)报道，Chlorella vulgaris 在含有 70.02mg/L NaN03 的正常培养基中最大油脂含量仅有26%，将藻转入缺氮(0.02mg /L)培养基中连续培养，在缺氮条件下培养7天和17天时，藻类的油脂含量才能分别达到36%和43%。添加一些特殊成分来诱导的方式由于添加了一些物质，可能会一定程度上造成水体的污染。
【发明内容】
[0005]为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用氧化剂处理微藻高效诱导中性脂快速积累的方法，该方法简单易行，以氧化剂为诱导因子，能快速提高微藻细胞内中性脂的含量，降低生物能源的生产成本，实现生物柴油原料的环境友好型的高效生产，而且对水体环境污染小。特别是以氧化剂H202作为诱导因子时，H202在光照下能快速降解为H20和02，对水体环境零污染。
[0006]实现本发明上述目的所采用得技术方案为:
[0007]—种利用氧化剂处理微藻高效诱导中性脂快速积累的方法，其步骤是:
[0008]1)自养培养:根据微藻的种类选择相应的自养培养基进行微藻的常规自养培养；
[0009]2)氧化剂诱导处理:将微藻培养至对数生长中期时，开始以1?2mL/min的速度向自养培养基中滴加含有氧化剂的溶液，同时搅拌自养培养基使含有氧化剂的溶液均匀分布，当溶液中氧化剂的终浓度为0.15?1.5mM时，停止滴加含有氧化剂的溶液，继续进行微藻的自养培养；
[0010]3)继续自养培养24?48小时后，结束培养。
[0011]对上述技术方案进一步改进，所述微藻为绿藻；所述绿藻为小球藻；所述氧化剂为h202或作用于光合系统与呼吸系统的氧化剂；所述作用于光合系统与呼吸系统的氧化剂为孟加拉玫瑰红Rose Bengal (RB, 一种典型的光激发产生单线态氧的氧化剂)、过氧亚硝基Peroxinitrate (PN, 一种N0过氧化反应产生的含氮衍生物，作用于呼吸作用的氧化剂)、癸二烯酸Decadienal (DD, —种作用于线粒体膜细胞色素c的氧化剂)或甲基紫精MethylV1logen(MV，一种作用于光合电子传递链的氧化剂)；步骤2)中搅拌时的转速为50?lOOrprn。
[0012]由上述技术方案可知，该方法首先将微藻置于自养培养基中进行常规自养培养，当微藻处于对数生长中期时，开始缓慢滴加含h202或作用于光合系统与呼吸系统的氧化剂孟加拉玫瑰红、过氧亚硝基、癸二烯醛和甲基紫精其中的一种的溶液，将氧化剂h202、孟加拉玫瑰红、过氧亚硝基、癸二烯醛或甲基紫精作为诱导因子诱导微藻，只需诱导培养24?48小时，就能使微藻内中性脂的含量与使用其他诱导方法处理微藻所产生的中性脂的量持平或更高。因此，该方法能使微藻内中性脂快速积累，提高生物柴油原料的生产率，降低生物柴油原料的生产成本。更重要的是，当使用氧化剂H202作为诱导因子时，H202在光照下能快速降解为H20和02，对水体环境实现零污染。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于:
[0014]1)该方法中微藻采用常规的光合自养培养模式，整个培养过程操作方便，稳定可控。
[0015]2)该方法能快速提高微藻细胞内中性脂的含量，显著缩短微藻的诱导培养时间，同时能大幅度提高微藻中中性脂的含量，显著提高生物柴油原料的生产率，显著降低生物柴油原料的生产成本。
[0016]3)该方法选用光敏感和作用于光合系统或呼吸系统的氧化剂，适用于光合自养培养微藻的氧化诱导处理，诱导效率高。特别是选用h202作为氧化剂进行诱导时，对水体环境零污染。因此，该方法是一种环境友好型、高效和提高微藻内中性脂生产率的技术。
【附图说明】
[0017]图1为实施例1中采用氧化剂处理法培养的小球藻和常规自养培养法培养的小球藻内中性脂积累的显微细胞检测图。
[0018]图2为采用缺氮胁迫法培养的小球藻中中性脂积累的显微细胞检测图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明进行详细