用于细胞凋亡调解子基因缺失突变的快速检测方法及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药和生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种序列检测试剂盒。更 具体地说，本发明涉及一种用于检测B頂基因缺失突变的检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] B頂基因是编码细胞凋亡基因 BCL2蛋白家族中的一个成员，在细胞凋亡中发挥重 要的调节作用。研究表明B頂基因外显子3和外显子4之间存在的2903bp的缺失会造成 B頂亚型BH3结构缺乏表达。而这种缺乏表达会导致肺癌病人对部分治疗药物有更强的耐 药性。在癌症病人体内，这种删除与药物反应的持续时间相关联，并且能够被用来预测病人 在没有疾病恶化时的存活时间。携带这种删除突变的那些病人的平均无疾病恶化存活期限 为大约6个半月时间，而没有这种突变的那些病人则为将近12个月。因此B頂缺失的检测 对于肺癌病人有相当重要的意义。
[0003] 目前对B頂基因突变检测的方法主要包括：电泳、测序、变性高效液相色谱 (DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。测序法因为可以读到DNA每个碱基 的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法，但因为灵敏度低，检测异质性较高的临 床肿瘤组织样本时假阴性率高，同时，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员要求较高， 不易形成标准化操作的临床诊断产品。DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也因为操作复杂， 对设备要求高。目前仅在科研单位实验室应用。
[0004] 综上所述，为了最终实现治疗肺癌，本领域迫切需要寻求肺癌易感基因，并开发检 测易感基因的方法、试剂盒，以及相关治疗药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测（包括早期诊断）B頂基因缺失情况的方法及其检 测试剂盒。
[0006] 本发明的目的是提供一种检测基因缺失情况的方法，即检测B頂基因第三、 第四外显子之间的内含子上2903bp缺失突变情况，缺失型个体相对普通人群对某些药物 的耐药性更高。
[0007] 本发明提供了一种细胞凋亡调解子基因 B頂的检测方法，该方法包括步骤：
[0008] (a)抽提样品的基因组DNA，用B頂缺失检测特异性引物扩增样品的基因组DNA，得 到扩增产物；
[0009] (b)检测扩增产物中B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失 的区域。
[0010] 其中，检测扩增产物中B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺 失的区域使用荧光PCR检测。
[0011] 所述的B頂缺失检测特异性引物的序列可以为SEQ ID N02和SEQ ID N03。
[0012] 扩增B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失的区域的引物序 列为 SEQ ID N02、SEQ ID N03 或者 SEQ ID N04。
[0013] 检测B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失区域的探针序列 为 SEQ ID N05 或者 SEQ ID N06。
[0014] 另一方面，本发明还提供了一种检测细胞凋亡调解子基因 B頂的试剂盒，它含有 与B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失片断结合的探针。
[0015] 在本发明的一个实施例中，与B頂基因结合的探针的序列为SEQ ID N0 :5或者SEQ ID N0 :6〇
[0016] 该试剂盒还包括特异性扩增B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上包含 2903bp缺失的区域的引物。
[0017] 特异性扩增B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失的区域的 引物序列为 SEQ ID N02、SEQ ID N03 或者 SEQ ID N04。
[0018] B頂基因的详细序列可参见登见美国国立生物技术信息中心（NCBI)(可参见网址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/) 〇
[0019] 所述的2903bp缺失，位于B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上（脱氧核糖 核酸（DNA)序列编号：2903bp缺失位置基于SEQ ID N0 :1/8,上游引物基于SEQ ID N0:2/8 ; 下游引物1基于SEQ ID :3/8 ;下游引物2基于SEQ ID :4/8 ;扩增产物基于SEQ ID :5/8、 6/8 ;探针 1 基于 SEQ ID NO :7/8 ;探针 1 基于 SEQ ID NO :8/8。
[0020] 检测所述的2903bp缺失的方法可以是测序、荧光PCR等。
[0021] 本发明的方法，具体而言，包括以下步骤：
[0022] (a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上 包括2903bp缺失在内的产物；(b)检测步骤（a)产物中2903bp缺失情况。
[0023] 所述的扩增B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失的引物序列如 SEQ ID N02 和 SEQ ID N03 所示。
[0024] 所述的检测B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失的探针序列如 SEQ ID N07 和 SEQ ID N08 所示。
[0025] 上述方法中涉及的扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操作方 法。
[0026] 上述试剂盒还可以包括特异性扩增B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上 2903bp缺失区域的引物。
[0027] 上述试剂盒还可以包括检测B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺 失区域的探针。
[0028] 在本发明的一个实施例中，与特异性扩增B頂基因第三、第四外显子之间的内含 子上2903bp缺失区域的引物的序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
[0029] 在本发明的一个实施例中，与B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp 缺失区域结合的探针的序列如SEQ ID N07和SEQ ID N08所示。
[0030] 本发明的目的是提供一种检测B頂基因缺失情况的方法，即检测B頂基因第三、 第四外显子之间的内含子上2903bp缺失突变情况，相关研究表明缺失型个体相对普通人 群对某些药物的耐药性更高。
[0031] 本发明的目的是提供一种检测WM基因缺失情况的方法，包括步骤：检测该个体 的B頂缺失情况，以此判断个体是否有耐药可能性高于普通人群。
[0032] 在一优选例中，所述的差异是选自2903bp的缺失情况。2903bp的缺失位于B頂基 因第三、第四外显子之间的内含子上。其中脱氧核糖核酸（DNA)序列编号：2903bp缺失位 置基于 SEQ ID N01/8。
[0033] 本发明提供了一种检测样品是否存在B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上 2903bp缺失的方法，包括步骤：
[0034] (a)用B頂缺失检测特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；
[0035] (b)检测扩增产物中缺失情况。
[0036] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以 对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0037] 本发明提供了一种用于细胞凋亡调解子基因（B頂）缺失突变的快速检测试剂盒 及检测方法。其优点在于：
[0038] 1、通量更高：相比传统的PCR而言，我们使用R〇che480实时荧光定量系统，通量更 商。
[0039] 2、速度更快：传统的方法需要扩增几千bp的片段，另需要进行电泳鉴定扩增片 段，实验时间预计在5个小时以上，而我们的方法只需要扩增100个bp左右的片段，所有实 验在2个小时内即可完成。
[0040] 3、结果更直观：传统的结果需要进行电泳分析，耗时耗力。而本方法只需要在实时 PCR结束后进行分析即可获得结果。
[0041] 4、结果更准确：众所周知，每开盖一次便增加一次污染的可能性，相较传统检测需 要开盖后进行电泳而言，本方法无需开盖，将污染可能性降到最小的程度。为B頂基因缺失 检测提供了一个简捷的新途径。
【附图说明】
[0042] 图1是B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失的检测结果。
[0043] 图2是测序结果截图。
[0044] 显示了 B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失情况的测序结果。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合【具体实施方式】和实验详细说明本发明的特征，但是，可以理解的是，说明 书的【具体实施方式】仅仅用于对本发明进行说明，并不能被解释为对本发明的限制。下列实 施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验 室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
[0046] 实施例1荧光PCR检测
[0047] 一、实验材料
[0048] LightCycler? 480II荧光定量PCR仪购自瑞士 Roche公司，聚合酶链式反应液 (TaqMan Express Master Mix)由美国应用生物系统公司（ABI)定制合成。
[0049] 二、引物设计与合成：
[0050] 以BIM基因的部分序列为模板，使用Primer Premier5软件分析设计引物，并由生 工生物合成。
[0051] 检测用引物：
[0052] BIM 基因缺失检测上游引物序列：5' -ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG-3'（SEQ ID N02)
[0053] BIM 基因缺失检测下游引物 1 序列：5' -CCCAACCTCTGACAAGTGACC'（SEQ ID N03)。
[0054] B頂基因缺失检测下游引物 2 序列：5' -TTGGTGGGAATGTAAAATGGC-3'（SEQ ID N04)。
[0055] 荧光探针：
[0056] BIM 基因缺失检测荧光探针 1 :5 ' -VIC-CCAACCTCTGACAAGTGA-MGB-3 ' (SEQ ID N07)
[0057] BIM 基因缺失检测荧光探针 2 :5 ' -FAM-TTGGTGGGAATGTAAAAT-MGB-3 ' (SEQ ID N08)
[0058] 三、样本检测：
[0059] 实验共检测30例肺癌病例和30例正常对照人群，，每例收集血样标本约2mL，用浓 盐法抽提基因组DNA，抽提结果用Nanodrop (Thermo公司）检测。
[0060] 按如下体系进行荧光PCR扩增，后用LightCyclerf 480II荧光定量系统进行溶解 曲线分析：
[0063] 四、检测结果
[0064] 基因组DNA抽提的检测结果：
[0065] 所有用本的基因组DNA附和检测要求（260/280>1. 8,浓度>10ng/ul)。
[0066] B頂基因缺失检测结果：
[0067]
[0068] 实施例2
[0069] 用测序方法检测B頂基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失情况，挑 选上述病例样本10例，对照样本10例进行测序判断B頂缺失情况。
[0070] 一、实验方法
[0071] PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的 仪器是ABI公司的3730x1遗传分析仪，用sequence analysis5. 2分析软件进行分析，结果 用chromas也可以查看。
[0072] 二、实验结果
[0073] 测序结果截图如图2所示。
[0074] 最终，10例测序结果与LightCycleW 480II荧光PCR的分析结果完全一致。
[0075] 三、B頂基因 2903bp缺失和肺癌易感的关联分析
[0076] B頂基因 2903bp缺失在肺癌病人和对照中分布的比较采用RxC X 2检验.用SPSS 软件进行统计分析，检测结果的SPSS软件分析结果如下表所示：
[0078] 本发明涉及序列如下：
[0079] SEQ ID N01
[0080] 长度：4511
[0081] DNA
[0082] 智人（homo sapiens)
[0083] AACCATGAAAATGGTTTGTTTTCTGCCTAAATTCCTCTTTGTGCTTATTGCTCAGAGGGTTTGGACATA GTACTAATCAGATTAGGTTGTAGGTTTTTATTTCAGGGATTAAAGGCAGTAGTAGGGTTTGAACCAAGAGTGGCTAA CATAAATACCACAGAGGCCCACAGCAAAATCATGGAAGGAACTGACCTGGTGGAGACTGGTAAATTGGAGAGTATTT GCCCCTTCTATGTTTGGGCCACACCTAATTGTGGCTGTGAGGGCATGTGGTCTCAGGGTGGGTTTTCCTATATTGCA AGATAACCTAGGAATGCAAAATTGATGCCAGATACCCTGTTTCAACATTGACAGCTGATTCAGATTTTGAAAACATT GTACAAGCTGAAAAGAAACATCTGCAGACTTGATTTGGCCCTTGAACCTACAGCATGTGACTTTGGGTACATACTTT GGGTAACCTTGGTGAGGGGCTGAGTCTGTGTTGATCGACTTGCTGTTCCCCACCAATGGAAAAGGTTCATGTCTTGA TCAGTAGTCAATCACATTGACCATTTGTCCAGATTAGCTTGCCATACATGAACAAGATAGAAGTAAGTTGGTAGAGT TATCAATTAGGAAACCCAGTACAGAGTCTATTATAATTTAGATTGTACCTCATGATGAAGGCTAACTCAACAAACCC AT