标准为： (1) 新发女性乳腺癌患者； (2) 单侧乳腺癌，且病理确诊为三阴性乳腺癌，浸润性导管癌； (3) 确诊时无转移病灶；无其他肿瘤病史； (4) 排除其他导管原位癌。
[0014] 二·实验方法 采集上述训练集165例患者的手术切除癌组织标本，同时包括35例与癌组织配对的癌 旁组织标本；利用Qiagen公司的Rneasy Plus Mini Kit，按照试剂盒说明，抽提RNA样本。 抽提后的RNA，利用NanoDrop 2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量；所提取的 RNA样本冻存于-80 °C的深低温冰箱中。
[0015] 用美国 Affymetrix 公司的 GeneChip Human Transcriptome Array 2. 0 (ΗΤΑ 2. 0)芯片检测三阴性乳腺癌的转录组谱；该芯片可检测出超过285,000个转录本；按照 AfTymetrix HTA2. 0芯片操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行全转录 组表达谱的检测。
[0016] 读取芯片数据后，将原始信号值小于1的都以1替代，以芯片内部参考基因表达为 参照对结果进行标化处理；利用33对癌与癌旁组织芯片表达数据，通过Random Variance Model计算出各RNA在癌与癌旁差异表达情况；依此为基础，筛选出癌与癌旁差异表达的 RNA〇
[0017] 将上述33例癌组织结果与另外132例癌组织检测结果一同，和患者的临床随访信 息相关联，利用C0X比例风险回归模型（BRB-Array Tools)计算每个RNA与RFS的相关性。
[0018] 将筛选出来的RNA通过C0X比例风险回归模型，构建预后预测模型，得出RS计 算公式：X为每个RNA在两分类方法中的赋值，B为每个RNA的权重系数；RS=B1*X1+··· +B10*X10.根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，进而判断患者复发风险大小。 通过COX多因素比例风险回归模型及Time-dependent ROC曲线对所构建RNA模型的预测 效能进行评价。
[0019] 三.实验结果 共检测了训练集165例三阴性乳腺癌组织及35例三阴性乳腺癌癌旁组织。
[0020] 筛选出的RNA基本信息如表1所示，其中包括了 8个mRAN和2个IncRNA ; 表1.纳入模型的RNA基本信息
， 根据得出的模型计算出每位患者的RS值，并利用Time-dependent ROC曲线选取最 优界值点为〇. 22,将患者划分为高危（RF>0. 22)和低危（RF〈=0. 22);多因素回归分析，校 正常见的临床病理指标(如肿瘤大小，分级，淋巴结）后，结果显示，模型预测的高危患者 相较于低危患者具有更高的复发风险（HR=10. 00,95%CI: 2. 53-39. 47, P=0. 001).同时 Time-cbpendent ROC曲线评估预测的效用发现，模型相较于常见的临床病理指标及其只包 含mRNA的预测模型都具有更好的预测效用（如图1所示）。
[0021] 实施例2:预测模型的验证 本发明进一步在119例独立的三阴性乳腺癌患者（验证集）中进行了验证。
[0022] 一 ·实验对象： 本实施例的研究对象选择2009年1月至2010年12月间复旦大学附属肿瘤医院组织 库保存的三阴性乳腺癌组织119例，构成验证集；纳入及排除标准为： (5) 新发女性乳腺癌患者； (6) 单侧乳腺癌，且病理确诊为三阴性乳腺癌，浸润性导管癌； (7) 确诊时无转移病灶；无其他肿瘤病史； (8) 排除其他导管原位癌。
[0023] 二·实验方法 采集上述119例患者的手术切除癌组织标本；利用Qiagen公司的Rneasy Plus Mini Kit，按照试剂盒说明，抽提RNA样本；抽提后的RNA，利用NanoDrop 2000光谱仪定量检测 提取的总RNA的浓度及质量。所提取的RNA样本冻存于-80°C的深低温冰箱中。
[0024] 将上述米集的RNA样本用 Takara公司的PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time)，按照试剂盒操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行逆转录， 获取cDNA。
[0025] 根据SEQ ID No. 1-10的RNA序列及GAPDH序列设计特异性引物，并使用Takara 公司的SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)试剂盒，按照试剂盒操作说明所规定的 标准操作步骤，利用实时定量PCR技术检测如SEQ ID No. 1-10所示的RNA在所获取的cDNA 中的表达量；之后根据GAPDH的表达量，采用-Ct的方法对所有RNA的表达情况进行校 正。根据每个RNA在所有119例组织中表达的中位值，将RNA在各组织内的表达划分为高 低表达，并分别赋值为1和0。
[0026] 将已经完成赋值的RNA表达量，带入上述实施例1中创建的模型内，计算验证集中 每位患者的复发风险；通过C0X多因素比例风险回归模型及Time-cbpendent R0C曲线对所 构建RNA模型的预测效能进行评价。
[0027] 三.实验结果 通过相关分析，本发明确定了芯片检测与实时定量PCR检测的趋势的一致性；根据上 述实施例1的模型计算出每位患者的RS值，并采用实施例1的最优界值点，将患者划分为 高危（RF>0. 22)和低危（RF〈=0. 22);在验证集中，多因素回归分析，校正常见的临床病理指 标(如肿瘤大小，分级，淋巴结）后，结果也显示模型预测的高危患者相较于低危患者具有更 高的复发风险（服=5.73,95%(：1:1.17-29.40，？=0.037);同时111116-(1印611(161^1?0(：曲线评 估预测的效用发现，模型相较于常见的临床病理指标及其只包含mRNA的预测模型都具有 更好的预测效用（如图1所示）；因此，本发明在独立的119例三阴性患者人群中验证所述 的mRNA联合IncRNA模型预测的有效性。
[0028] 实施例3对于紫杉类药物为基础的化疗敏感性的预测作用 本发明进一步测试mRNA联合IncRNA模型是否能够预测紫杉类药物为基础的化疗敏感 性。在训练集和验证集中分别进行了交互作用分析；交互作用分析的原理在于若是两项因 素间存在着交互作用，则说明二者间存在着依赖关系，其中一个因素的变化能够预测另一 项因素的变化情况；结果如表二所示，无论是在训练集中还是在验证集中，是否接受含紫杉 类药物的化疗与模型间都存在在明显的交互作用；结果表明，本发明所述的模型对于紫杉 为基础化疗与RFS的关系，模型是可预测的。
[0029] 表二：模型与是否含紫杉类药物化疗间的交互作用分析
【主权项】
1. 一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合IncRNA模型，其特征在于，所 述模型包括SEQIDNo. 1-10中一个或多个RNA。2. 权利要求1所述的mRNA联合IncRNA模型构建与鉴定方法如下： (1) 提取获得的癌组织的RNA样本； (2) 纯化组织的RNA样本； (3) RNA质量控制：用NanoDrop2000光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量； (4) 采用全传录组芯片检测所述乳腺癌与癌旁组织，进行过滤，标化处理后，去除差异 表达倍数不明显的探针，再利用生物信息学分析获得癌与癌旁组织差异表达的RNA，包括 mRNA和IncRNA;对另组三阴性乳腺癌癌组织进行HTA2. 0芯片检测，将该结果与上述癌组织 结果组成训练集，利用单因素C0X比例风险回归模型，计算每个差异表达RNA与患者无复发 生存的关系，筛选其中差异表达以及与疾病RFS相关的RNA(如SEQIDNo. 1-10所示）； (5) 计算上述10个RNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者RFS 的风险指数，根据计算得出的RS值，将患者划分为高危和低危，判断患者复发风险大小， 并依该预测患者对于紫杉为基础化疗的敏感性；通过C0X多因素比例风险回归模型及 Time-dependentR0C曲线对所构建RNA模型的预测效能进行评价； (6) 将上述所得的RNA模型及计算公式，在三阴性乳腺癌患者中进行验证：获取独立 的另组三阴性患者的癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，利用实时定量PCR检测如SEQ IDNo. 1-10所示RNA的表达量，并利用GAPDH作为内部参照进行校正；依据表达水平对 每个RNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；判断每位患者的 复发风险，同时预测其对紫杉为基础化疗的敏感性；通过C0X多因素比例风险回归模型及 Time-dependentR0C曲线对RNA模型的预测效能进行评价。3. 按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（5)中，风险指数的计算公式： RS=B1*X1+···+B10*X10 ;其中，X为每个RNA在两分类方法中的赋值，B为每个RNA的权重系 数。4. 权利要求1所述模型在制备预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的芯片或试剂或 试剂盒中的应用。5. 权利要求1所述模型在制备采用实时定量PCR预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性 的产品中的应用。6. 按权利要求5所述的应用，其特征在于，所述采用实时定量PCR预测三阴性乳腺癌预 后及化疗敏感性的产品含有针对SEQIDNo. 1-10中一对或多对RNA特异性引物。7. 按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感 性的试剂含有针对SEQIDNo. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸。8. 按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感 性的试剂盒含有针对SEQIDNo. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸。9. 按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感 性的芯片含有针对SEQIDNo. 1-10中一个或多个RNA特异性探针核苷酸。10. 按权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述芯片或试剂或试剂盒通过下述方 法预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性，检测癌组织样品中SEQIDNo. 1-10中一个或多 个RNA的表达水平，预测三阴性乳腺癌患者预后及对化疗的敏感性。
【专利摘要】本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种预测三阴性乳腺癌预后及化疗敏感性的mRNA联合lncRNA模型及应用；所述模型包括SEQ？ID？NO.？1-10中一个或多个RNA。本发明通过检测患者mRNA和lncRNA表达水平，可应用于临床判断三阴性患者预后及化疗敏感性。与其他已知与疗效相关的临床病理因素相比，本发明所述模型为一个独立的预测因素；所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105316402
【申请号】CN201510154056
【发明人】邵志敏, 江一舟, 刘依熔, 徐晓恩, 余科达, 胡欣, 姚玲, 周平, 金希, 马丁, 欧周罗, 狄根红, 柳光宇, 吴炅
【申请人】复旦大学附属肿瘤医院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年4月2日