一种基于下一代测序技术检测hbv耐药突变位点的引物、方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因组学和分子生物学领域，具体而言涉及一种基于下一代测序技术 检测HBV耐药突变位点的引物、方法及应用。
【背景技术】
[0002] HBV基因组在复制过程中，在经过RNA逆转录复制过程中，因 RNA聚合酶和逆转录 酶缺乏严格的校正机制，使病毒基因的复制过程中极易发生核苷酸的错配，因此，HBV是一 种变异性极高的病毒。在机体自身、药物和病毒的多重作用下，HBV DNA聚合酶的逆转录活 性区（RT区）会发生多种耐药突变。耐药突变不仅会降低抗病毒治疗的效果，还会使乙型 肝炎进一步进展、恶化。HBV基因变异及其导致的药物靶位氨基酸的替代是导致病毒耐药的 基础，所以对HBV耐药突变位点的检测极具临床意义。
[0003] 目前HBV耐药突变位点的检测方法主要有PCR-测序法（sanger测序法）、 real-time PCR法、Pyrosequencing焦磷酸测序技术、基因芯片法、PCR-限制性片段长度多 态性分析法（RFLP)等。其中，PCR-测序法可以同时检测多个耐药位点的突变及未知突变， 假阳性率低，是临床上应用的主要方法，但其灵敏度低（变异菌株超过HBV准种池20% )， 难以检测各突变位点发生变异率，且易出现假阴性结果。real-time PCR法虽然灵敏度高， 但只能检测已知、单一位点的变异。RFMP和基因芯片法，价格昂贵、操作繁琐、数据分析工作 量大、存在碱基错配等缺点，较适合研究目的，不太适合临床应用。Pyrosequencing焦磷酸 测序技术可以全面快速检测突变位点，且准确灵敏。
[0004] 刘玲等在《中西医结合肝病杂志》，2013年第23卷第3期，报道了一种巢式PCR联 合焦磷酸测序检测乙肝病毒耐药基因的方法。针对HBV P基因 RT区的8个耐药位点，在其 上下游分别设计两对特异性引物，构建巢式PCR扩增体系，结合焦磷酸测序8个耐药位点的 检测。
[0005] 然而，在运用巢式PCR的过程中，需要设计2对引物，进行2轮PCR，以提高扩增特 异性。发明人在实践中发现，很多巢式PCR产物加 Adaptor后，片段长度差异不明显，且数 目多，在琼脂糖凝胶电泳中很难分离，严重影响下一代测序在HBV耐药突变位点检测中的 应用。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测HBV耐药突变位点 的引物、方法及应用。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测HBV耐药突变位点的引 物，包括引物对，所述引物对为如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示的核苷酸序列，或 为如SEQUENCE N0. 3和SEQUENCE N0. 4所示的核苷酸序列。
[0008] 具体地，
[0009] SEQUENCE NO. 1(5, -3,）：TGTWTCCCTCHTGTTGCTGT ;
[0010] SEQUENCE NO. 2(5, -3,）：TGRCAKACYTTCCAATCAATAG ;
[0011] SEQUENCE NO. 3 ：CHTGTTGCTGTACAAAACCT ；
[0012] SEQUENCE NO. 4 ：GCAGGATAWCCACATTG〇
[0013] 如本发明所述地，碱基"1、!1、1?、1(、￥"为本领域常规含义，其中，1 = 4/1'，!1 = 4/(：/ T，R = A/G，K = G/T，Y = C/T〇
[0014] 本发明提供的引物对用于扩增HBV RT片段（HBV552~HBV992)，覆盖了 10个耐药 突变位点。其中，SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示引物对的具体信息如下表1所示：
[0015] 表1用于HBV基因型突变的引物序列
[0017] 优选地，所述HBV耐药突变位点为乙肝病毒逆转录酶区中的169、173、180、181、 184、194、202、204、236和250位点中的至少一种。
[0018] 进一步优选地，所述 HBV 耐药突变位点为 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、 rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T、rtM250V 和 rtM250I 中 的至少一种。
[0019] 第二方面，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测HBV耐药突变位点的方 法，包括以下步骤：
[0020] 1)取待测样品，配置PCR体系进行一轮PCR扩增；其中，PCR体系中的引物对为如 SEQUENCE NO. 1 和 SEQUENCE N0. 2 所示的核苷酸序列，或为如 SEQUENCE N0. 3 和 SEQUENCE NO. 4所示的核苷酸序列；
[0021 ] 2)纯化一轮PCR扩增产物，并进行测序，检测文库中的HBV耐药突变位点。
[0022] 优选地，所述HBV耐药突变位点为乙肝病毒逆转录酶区中的169、173、180、181、 184、194、202、204、236和250位点中的至少一种。
[0023] 进一步优选地，所述 HBV 耐药突变位点为 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、 rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T、rtM250V 和 rtM250I 中 的至少一种。
[0024] 优选地，所述步骤（1)中，所述待测样品为抽提得到的HBV DNA。
[0025] 进一步优选地，所述引物对为如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE NO. 2所示的核苷酸 序列，或者是如SEQUENCE NO. 3和SEQUENCE NO. 4所示的核苷酸序列。
[0026] 优选地，所述步骤（1)中，一轮PCR扩增时，SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2的 使用浓度分别为〇. 25 μ Μ和0. 25 μ Μ。
[0027] 优选地，所述步骤（1)中，一轮PCR为温度梯度PCR，温度梯度优选-1°C /cycle，共 lOcycles。退火温度最高优选为65°C。
[0028] 进一步优选地，所述步骤（1)中，所述一轮PCR的程序设置如下：
[0030] 优选地，所述步骤（2)中，采用如下任一一种方法进行测序：
[0031] (2-a)取纯化后的一轮PCR扩增产物构建下一代测序文库；并采用下一代测序技 术检测文库中的HBV耐药突变位点；或
[0032] (2-b)直接取纯化后的一轮PCR扩增产物进行sanger测序。
[0033] 进一步优选地，所述步骤（2-a)中，取纯化后的一轮PCR扩增产物构建下一代测序 文库的步骤为：对纯化后PCR产物分别添加碱基A、二代测序公司接头序列、二代测序公司 标签序列，获得所述的下一代测序文库。
[0034] 优选地，所述步骤（2-a)中，所述的下一代测序技术采用Illumina测序平台，特别 适用于Miseq测序或Hiseq测序平台。
[0035] 第三方面，本发明提供一种基于下一代测序技术检测HBV耐药突变位点的试剂 盒，包括如下引物对，所述的引物对为如SEQUENCE NO. 1和SEQUENCE N0. 2所示的核苷酸序 列，或为如SEQUENCE N0. 3和SEQUENCE N0. 4所示的核苷酸序列。
[0036] 优选地，所述HBV耐药突变位点为乙肝病毒逆转录酶区中的169、173、180、181、 184、194、202、204、236和250位点中的至少一种。
[0037] 进一步优选地，所述 HBV 耐药突变位点为 rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V、 rtA181T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V、rtM204I、rtN236T、rtM250V 和 rtM250I 中 的至少一种。
[0038] 第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的基于下一代测序技术检测HBV耐药 突变位点的引物、如第二方面所述的基于下一代测序技术检测HBV耐药突变位点的方法或 如第三方面所述的基于下一代测序技术检测HBV耐药突变位点的试剂盒在检测HBV耐药突 变位点中的应用。
[0039] 本发明提供的技术方案中，特别针对下一代测序平台设计的引物对只需要1轮 PCR，具有较高的稳定性、特异性和灵敏度；在本发明一个优选的实施例中，PCR产物加 Adaptor后，片段长度差异明显，仅2个条带，在琼脂糖凝胶电泳中非常容易区分（片段长度 为441bp，加接头后为565bp)。
[0040] 本发明提供的技术方案适合采用下一代测序平台进行HBV耐药突变位点的检测， 尤其适合Illumina测序平台，特别适用于Miseq测序或Hiseq测序平台。
【附图说明】
[0041 ] 图1是实施例2的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果；
[0042] 图2是实施例3的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果；