一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶联免疫技术领域，具体的说是设及一种苏丹红II多克隆抗体的制备 方法。
【背景技术】
[0002] 苏丹红学名苏丹（Sudan)，共分为苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III和苏丹红IV。苏丹 红为亲脂性偶氮染料，主要用于油彩、机油、蜡和鞋油等产品的染色。由于用苏丹红染色后 的食品颜色非常鲜艳且不易稱色，能引起人们强烈的食欲，一些不法食品企业把苏丹红添 加到食品中。常见的添加苏丹红的食品有辣椒粉、辣椒油、红豆腐，红屯、禽蛋等。
[0003] 由于苏丹红是一种人工合成的一种工业染料，1995年欧盟巧U)等国家已禁止其 作为色素在食品中进行添加，对此我国也明文禁止。但由于其染色鲜艳，印度等一些国家在 加工辣椒粉的过程中还容许添加苏丹红I。抓对从印度进口的红辣椒粉中检出苏丹红，其 检出苏丹红I的量为2. 8-3500mg/kg。同时在一些其它食品中也检测到运种物质，如一些调 味品中苏丹红I的含量达到0. 7-170mg/kg。也有一些报道称，在辣椒粉中还可检测到苏丹 红II、ΙΠ和IV，如在辣椒粉和辣椒酱中检出苏丹红IV的含量分别为230和380mg/kg，但辣椒 粉中一般多W检出苏丹红I为主。英国食品标准局灯he化odStandardAgency，FSA)就含有 添加苏丹红色素的食品向消费者发出警告，并在其网站上公布了可能含有苏丹红I的产品 清单。截至2月24日，清单上的产品增加到了 474种，包括香肠、泡面、熟肉、馆饼、辣椒粉、 调味酱等产品。
[0004]欧洲调味品协会专家委员会（theExpertCommitteeonFlavouringsof theCouncilo巧urope)的资料信息显示，欧洲每天红辣椒粉的人均消费量为50-500mg，而 红辣椒粉中苏丹红I的检出量为2. 8-3500mg/kg，从而推算欧洲人每天苏丹红I的人均可能 摄入量为0. 14-1750μg。而在法国向欧洲调味品协会专家委员会提交的一份报告中指出， 人均每天辣椒（包括红辣椒和辣椒粉）的消费量和最大消费量分别为77和264mg，按辣椒 粉中苏丹红I的检出量2. 8-3500mg/kg进行推算，则欧洲人每天人均苏丹红I的摄入量为 0. 2-270μg，最大摄入量为0. 7-924μ邑。 阳〇化]鉴于苏丹红II给人类带来健康的潜在风险，开发一种简单、快捷制备用于检测苏 丹红II的多克隆抗体显得尤为重要。
[0006] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或W任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种苏丹红II多克隆抗体的制备方 法。
[0008] 本发明提供的技术方案为：
[0009] 一种苏丹红II多克隆抗体的制备方法，包括W下步骤：
[0010] (1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；
[0011] (2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价； 阳01引 做若血清效价达到要求，则大量采血，离屯、取上清，得到抗血清；
[0013] (4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗苏丹红II抗体与偶联在 抗原免疫亲和填料上的活性苏丹红II特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗苏丹红II 多克隆抗体。
[0014] 作为优选，步骤（1)中所述的全抗原包括苏丹红II-KLH和苏丹红II-BSA。
[0015] 作为优选，所述的全抗原，其制备方法包括W下步骤：
[0016] (1)先用十二烷基硫酸钢分别变性钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；
[0017] (2)再分别用热的二硫苏糖醇对变性后的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白进行还原， 然后分别用葡聚糖凝胶脱盐后，得到琉基化的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；
[00化](3)分别再用饱和碳酸钢溶液调抑=8. 5,然后滴入已制备好的3/8体积的活 性苏丹红II组分与钥孔血蓝蛋白，室溫反应比，再经葡聚糖凝胶脱盐后，即制得苏丹红 II-KLH全抗原，已制备好的1/8体积的活性苏丹红II组分与牛血清蛋白同样操作反应即制 得苏丹红II-BSA全抗原。
[0019] 作为优选，所述的全抗原苏丹红II-KLH做注射用；所述的全抗原苏丹红II-BSA做 检测包被用。
[0020] 作为优选，所述的活性苏丹红II组分，其制备方法包括W下步骤：
[0021] (1)将苏丹红II标准品溶解于无水氯仿中，在无水氯化侣的作用下与漠乙酷氯反 应，得到具有活性的漠乙酷氯苏丹红II混合物；
[0022] (2)将得到具有活性的漠乙酷氯苏丹红II混合物用制备型高效液相反向柱色谱分 离纯化，收集具有苏丹红II标准品紫外光吸收光谱特征的活性苏丹红II组分；
[0023] (3)将所收集的活性苏丹红II组分重新萃取到氯仿中，经旋转蒸发后再用丙酬复 溶后备用。
[0024] 作为优选，所述的活性苏丹红II组分按体积分为2等份，一份用于制备全抗原，另 一份用于制备抗原免疫亲和填料。
[00巧]作为优选，步骤（1)中所述的免疫动物为新西兰大白兔。
[00%] 作为优选，步骤（4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括W下步骤：
[0027] (1)取2g赖氨酸溶于10血0.Imol/L碳酸钢，充分溶解后加入到25血过舰酸钢氧 化的琼脂糖填料中混匀，60°C反应5min，摇匀再次反应lOmin，转4°C静置20min，然后加入 棚氨化钢lOOmg混匀还原，室溫摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；
[0028] (2)将25mL的赖氨酸琼脂糖填料转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馈水漂 洗；
[0029] (3)先用50mL50 %的冷丙酬洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层 时，再加入50mL75 %的冷丙酬洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再 次加入lOOmL100%冷丙酬洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有 0. 2mL^乙胺的20mL丙酬溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬 琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；
[0030] (4)取现配的150mgN服-舰乙酸活性醋，边振荡边加入至步骤做得到的重悬好 的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室溫避光反应60min;
[00川 妨去除赖氨酸琼脂糖填料中的液体，再用lOOmL100%丙酬洗1次，当溶液即将 完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.Imol/L肥L的50mL75%的冷丙酬洗1次，溶液即将完全 进入琼脂糖珠层时，用含有0.Imol/L肥L的50mL50%的冷丙酬洗1次，当溶液还剩1/3在 琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；
[0032] (6)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到琉基化琼脂糖填料；
[0033] (7)取1/2体积的活性苏丹红II组分加入lOOuL饱和碳酸钢，然后和悬浮在丙酬的 琉基琼脂糖珠填料室溫反应过夜；
[0034] 做用100血丙酬清洗，再用400血含0. 05 %吐溫20的憐酸缓冲液PBSt清洗，即 得到的抗原免疫亲和填料。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0036] (1)本发明的方法制备出的苏丹红II多克隆抗体具有高特异性、高亲和力的优点。
[0037] (2)本发明的方法在制备半抗原时，衍生苏丹红II标准品后用高效液相进行了纯 化，然后才制备全抗原，因此，本发明制备出来的多克隆抗体特异性高，敏感度高。
[0038] (3)传统方法是用硫酸锭沉淀或其它方法来纯化抗体，而本发明的方法是用抗原 免疫亲和填料来纯化多克隆抗体，得到的多克隆抗体纯度更高。
【附图说明】
[0039] 图1为苏丹红II标准品的色谱图；
[0040] 图2为经制备型高效液相色谱分离纯化的苏丹红II色谱图及主要衍生组分收集 峰图；
[0041] 图3为抗苏丹红II多克隆抗体间接ELISA的效价图；
[0042] 图4为抗苏丹红II多克隆抗体间接竞争ELISA的IC50图；
[0043] 有关附图标记的说明： W44] 1-苏丹红II标准品；2-苏丹红II主要衍生组分。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保 护范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0046] 除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语"包括"或其变 换如"包含"或"包括有"等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它 元件或其它组成部分。
[0047] 室施魁丄:抗苏丹红II多克隆抗体的制备
[0048] 1.1苏丹红II抗原的制备 W例 1. 1. 1取20mg苏丹红II溶解于1. 5mL无水氯仿中，加入50-100mg无水氯化侣粉 末，摇匀lOmin;
[0050] 1. 1. 2加入40uL漠乙酷氯，摇匀室溫反应30min后离屯、，取上清转移到一个10血 试管；
[0051] 1. 1. 3缓慢加入5血水，摇匀，慢慢放气，再激烈摇匀，静置lOmin后取底部红色氯 仿层于5mL试管；
[0052] 1.1.4加入0.5血95%的甲醇（册1(：初始液），离屯、取上清，用册1(：进行分离纯 化；
[0053] 1. 1. 5苏丹红II衍生物-漠乙酷氯苏丹红II用HPLC纯化条件是：流动相为95%甲 醇巧％的2%肥L，流速3血/分钟；收集7. 7-8min和9min的峰；
[0054] 1.1. 6在收集到的液体中加入同等体积的氯仿，激烈摇匀，取氯仿层用旋转蒸发 仪器抽干后，用分别用0. 5ml，0. 25ml，0. 25ml丙酬分3次复溶回收活性苏丹红II组分， 于-20°C避光保存备用（尽量在化内使用）； 阳化5] 1. 1.7用十二烷基硫酸钢（SD巧分别变性钥孔血蓝蛋白化LH)或牛血清蛋白 度SA)，再分别用热的二流苏糖醇值TT)还原，分别经葡聚糖凝胶（G25S巧hadex)脱盐后，得 到琉基化的KLH或BSA