一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生菌的培养技术领域，具体是指一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法。
【背景技术】
[0002]植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物中，木本、草本植物、单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌，目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。
[0003]植物内生菌是一类次生代谢产物丰富、应用前景广阔的资源微生物。近年来，植物内生菌由于能够产生丰富多样的具有农药活性的次生代谢产物，在自然界中具有重要的生态学作用，引起了人们广泛的关注并取得很大进展，从微生物中寻找发现新型先导化合物，是新农药研制的重要途径。内生菌作为微生物中的重要类群，其物种丰富，数量庞大，这为新农药的研究和开发提供了巨大的资源库。
[0004]现有技术中开始利用植物内生菌诱导白木香树结香，众所周知，沉香树在自然界中因遭受雷击、风折、虫害感染或人畜为害等各种伤害，自身会分泌树脂以修补受伤部位，但某些由于真菌感染受伤的部位很难完成真正意义上的愈合，因此开启了为治愈创伤持久的奇妙的沉香制造与累积过程，甚至要经过数百年漫长岁月的洗礼，才能诞生珍稀优质的沉香，沉香的稀有也促使了人工生产沉香的发展，利用植物内生菌诱导白木香树结香，结香的速度快、所产沉香的质量好，所以对植物内生菌的培养显的尤为重要，但是现有的植物内生菌的液体种在培养时针对性差，存在培养成本高、培养时间长和培养出来的生菌存活率低等缺陷，而且一般培养植物内生菌的培养基的组分也不是纯天然的，会添加一些化学物质，由于在利用生菌诱导白木香树产香时是要将生菌寄生到白木香树内，这样利用含有化学物质的培养基培养出来的生菌对白木香树结香具有一定的影响。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服以上技术缺陷，提供一种生菌存活率高、生菌生长速度快、培养成本低、纯天然的一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为:一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法，它包括如下步骤:
[0007](1)培养液的制作
[0008]液体种培养基配方:马铃薯70 %，木肩17 %、麸皮5 %、玉米粉4 %、黄豆粉1 %、蛋白胨0.5%、葡萄糖1 %、磷酸二轻钾0.2%、硫酸镁0.2%、维生素0.1% ;
[0009]按上述配方把原材料称好后，先把马铃薯切薄片置于干净的不锈钢锅中，加木肩，麸皮，玉米粉，黄豆粉加水煮沸，煮至马铃薯熟透而不烂为宜，用400目以上滤网过滤，滤出原液加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸二轻钾、硫酸镁、维生素，再加入原培养基配方总重量的12-15倍的洁净水调匀，再把培养液装入培养瓶中；
[0010](2)灭菌处理
[0011]把液体种培养中需要应用到的工具，如需要更换的胶头、气管、气接头、气源活性碳滤芯，把需要灭菌的工具装入专用聚丙稀袋中，与液体种培养瓶一并放入灭菌锅中高压灭菌；
[0012](3)移入接种室
[0013]液体种培养瓶灭菌冷却后，移入无菌室或接种箱，准备好一系列工具，利用巴斯消毒或紫外线灯照射半小时后，工作人员更换工作服进入接种室接种；
[0014](4)接种
[0015]在接种箱或接种室的无菌环境下，把原种瓶瓶口与培养瓶瓶口，用75度酒精擦拭，在过酒精灯火焰烧过，打开培养瓶瓶口，把内生菌液体种原种倒入培养瓶当中，更换培养瓶培养专用胶头，连接好培养瓶相关气接头，接种完成；
[0016](5)气调处理
[0017]培养瓶接好种后移入培养室，打开空气压缩机，使其空转排气5-10分钟，再连接培养瓶之前，培养气体经过灭过菌的活性碳滤芯，把气体调压到适当压力，把无菌气体送到培养瓶当中，同时打开胶头上用棉花塞住的排气阀，使其形成正压，来防止杂菌进入瓶中污染，在外围需要连接气接头时，必须用75度酒精擦拭，在酒精灯火焰上方完成连接；
[0018](6)内生菌的生长
[0019]在常温20度左右，经过3-5天的气调培养，内生菌液体种完成培养。
[0020]本发明具有如下优点:本发明的植物内生菌的培养整套设备投资额度少，步骤简单、容易操作，所培养的内生菌存活率高、生菌生长速度快、培养成本低，本发明中的液体培养基采用的是纯天然、无污染的材料，使内生菌培养出来对后续的使用具有更好的效果。
【附图说明】
[0021]图1是本发明一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法的培养瓶的结构示意图。
[0022]图2是本发明一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法的内生菌菌种在培养状态下的结构示意图。
[0023]图3是本发明一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法的内生菌菌种在导出状态下的结构示意图。
[0024]图4是本发明一种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法的多瓶一起培养的结构示意图。
[0025]如图所示:1、培养瓶，2、空气输入口，3、胶头，4、排气口，5、菌种压力输入口，6、导气管，7、培养液，8、气泡，9、1号培养瓶，10、2号培养瓶，11、3号培养瓶，12、4号培养瓶，13、5号培养瓶，14、6号培养瓶，15、连通器，16、管道灭菌输入端口，17、培养气体输入端口，18、压力气体输入端口，19、液体菌种输入端口，20、阀门。
【具体实施方式】
[0026]现有技术中用植物内生菌诱导白木香树结香的菌种主要包括以下菌种:假单胞菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、泛菌属、甲基杆菌属、链霉菌属、链轮丝菌属、游动放线菌属、诺氏卡菌属、小单胞菌等，利用植物内生菌诱导白木香树结香，结香的速度快、所产沉香的质量好，便于推广，在具体实施时，利用本发明的培养方法将液体种培养好之后，然后用接种机将液体种导入白木香树内。
[0027]实施例一
[0028]—种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法，其特征在于:它包括如下步骤:
[0029](1)培养液的制作
[0030]液体种培养基配方:马铃薯70%，木肩17%、麸皮5%、玉米粉4%、黄豆粉1%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1 %、磷酸二轻钾0.2%、硫酸镁0.2%、维生素0.1% ;
[0031]按上述配方把原材料称好后，先把马铃薯切薄片置于干净的不锈钢锅中，加木肩，麸皮，玉米粉，黄豆粉加水煮沸，煮至马铃薯熟透而不烂为宜，用500目的滤网过滤，滤出原液加入蛋白胨、葡萄糖、磷酸二轻钾、硫酸镁、维生素，再加入原培养基配方总重量的12倍的洁净水调匀，再把培养液装入培养瓶中；
[0032](2)灭菌处理
[0033]把液体种培养中需要应用到的工具，如需要更换的胶头、气管、气接头、气源活性碳滤芯，把需要灭菌的工具装入专用聚丙稀袋中，与液体种培养瓶一并放入灭菌锅中高压灭菌；
[0034](3)移入接种室
[0035]液体种培养瓶灭菌冷却后，移入无菌室，准备好一系列工具，利用紫外线灯照射半小时后，工作人员更换工作服进入接种室接种；
[0036](4)接种
[0037]在接种箱或接种室的无菌环境下，把原种瓶瓶口与培养瓶瓶口，用75度酒精擦拭，在过酒精灯火焰烧过，打开培养瓶瓶口，把内生菌液体种原种倒入培养瓶当中，更换培养瓶培养专用胶头，连接好培养瓶相关气接头，接种完成；
[0038](5)气调处理
[0039]培养瓶接好种后移入培养室，打开空气压缩机，使其空转排气5分钟，再连接培养瓶之前，培养气体经过灭过菌的活性碳滤芯，把气体调压到适当压力，把无菌气体送到培养瓶当中，同时打开胶头上用棉花塞住的排气阀，使其形成正压，来防止杂菌进入瓶中污染，在外围需要连接气接头时，必须用75度酒精擦拭，在酒精灯火焰上方完成连接；
[0040](6)内生菌的生长
[0041]在常温20度左右，经过3天的气调培养，内生菌液体种完成培养。
[0042]实施例二
[0043]—种用于诱导沉香结香的内生菌液体种的培养方法，其特征在于:它包括如下步骤:
[0044](1)培养液的制作
[0045]液体种培养基配方:马铃薯70 %，木肩17 %、麸皮5 %、玉米粉4 %、黄豆粉1 %、蛋白胨0.5%、葡萄糖1 %、磷酸二轻钾0.2%、硫酸镁0.2%、维生素0.1% ;
[0046]按上述配方把原材料称好后，先