列表中的序列2,质粒的结构示意 图见图2的左图。
[0131]2)、表达载体pxrOl的制备 [013引（l)mreB和启动子PmreB
[0133]提取大肠杆菌K-12系JM109SG(Escherichia coli JM109SG)(本实验室保存）的 基因组，^Escherichia coli JM109SG基因组为模板，Wpl5a-mreB F和pl5a-mreB R为 引物，用P化酶进行PCR扩增。
[0134] pl5a-mreB F :5' tta邑aact邑C邑attcttca邑ctcaca邑ccactt邑atactaac邑t邑3'
[0135] pl5a-mreB R :5' tattggtgcccttaaacgcccttcccctgcctgcatccS'
[013引得到1443bp的PCR产物，为目的基因mreB和驱动其表达的启动子PmreB,具有序 列表中序列3自5'末端第2126-3548位核巧酸，目的基因mreB的核巧酸序列为序列表中 序列3自5'末端第2485-3528位，启动子PmreB的核巧酸序列为序列表中序列3自5'末 端第2126-2484位核巧酸。
[0137] (2)含有复制子和氯霉素抗性基因的目的片段的获得
[0138]W皿eB-pl5a F和皿eB-pl5a R为引物，W pl5AMBA-aceA质粒为模板，用pfu酶 进行PCR扩增，得到2125bp的含有复制子和氯霉素抗性基因的目的片段，其中，复制子的核 巧酸序列为序列表中序列3自5'末端第1324-1868位，氯霉素抗性基因的核巧酸序列为序 列表中序列3自5'末端第36-695位核巧酸。
[013引 弓I物为：
[0140]mreB-pl5aF:5，tc邑邑at邑ca邑邑ca邑邑邑邑aa邑邑邑C邑tttaa邑邑邑caccaataacS，
[0141]mreB-pl5aR:5'ta邑tatcaa邑t邑邑ct邑t邑a邑ct邑aa邑aatc邑ca邑ttctaaaa邑c3'
[0142] 将上述（1)和（2)的两个片段通过Gibsonassembly同源重组方法连接，得到连 接产物，转化到大肠杆菌Transl-Tl中，得到转化子。
[0143] 提取转化子的质粒，送去测序，结果为获得含有上述2个片段的质粒，记作pxrOl， 其核巧酸序列为序列表中序列3,该质粒的结果示意图见图2的右图。
[0144]3)、表达载体P沈VA：Ml-Lacr-Ptrc-MinCD
[014引 （l)minCD基因的扩增
[0146] 采用在盐单胞菌化lomonasTDS中建立的IPTG诱导的Lacr-Ptrc启动子，构建过 表达细胞分裂抑制因子minCD的表达载体，具体如下：
[0147]WTD8野生型基因组为模板，MinCD-F和MinCD-R为引物进行PCR扩增，得 到1752bp的PCR产物，即为minCD基因，其核巧酸序列为序列表中序列4自5'末端第 3189-4914位核巧酸；
[0148]Wp沈VA434为模板，trcF和trcR为引物进行PCR扩增，得到1458bp的PCR产物， 即为Lacr-Ptrc片段，其核巧酸序列为序列表中序列4自5'末端第60-1517位核巧酸。
[0149]WminCD基因和Lacr-Ptrc片段为模板，用F24和R24为引物进行S0EPCR，得到 PCR产物，经过测序为序列表中序列4,命名为Lacr-Ptrc-minCD。
[0150] 用甜al和SacI酶切Lacr-Ptrc-minCD，得到的酶切产物与经过同样酶切的 pSEVA341 载体(TheStandardEuropeanVectorArchitecture(SEVA):acoherent pi曰tformforthe曰n曰lysis曰nddeploymentofcomplexprokaryoticphenotypes. NucleicacidsresearchAl, 75(2013).)连接，得到连接产物，然后电转化至E.coliS17-1 中，在LBCm"平板上筛选阳性转化子。
[0151] 将阳性转化子进行菌落PCR鉴定，引物R24，F24进行菌落PCR验证，得到3301bp 的为阳性克隆。将阳性克隆提取质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列4所示的核巧 酸Lacr-Ptrc-MinCD插入P沈VA341载体的甜al和SacI酶切位点间得到的载体，命名为 P沈VA：Ml-Lacr-Ptrc-MinCD。
[0152] 表1为克隆minCD的扩增引物序列
[0153]
[0154] 下划线表示SOEPCR的互补重叠区，也是26bp的SD序列。加粗表示酶切位点。
[0155]3、工程菌EscherichiacoliJM109SGΔmreB(ptk01，pBHR68)、E.coli JM109SG(pxr01，pBHR68)和TD08(p沈VA341-Lacr-Ptrc-MinCD)的构建
[015引 pBHR68载体记载在如下文献中：SpiekermannP，RehmBHA，Kalscheuer 民，BaumeisterD，SteinbuchelA(1999)Asensitive,viable-colonystaining methodusingNileredfordirectscreeningofbacteriathataccumulate polyhydroxyalkanoicacidsandotherstoragecorn-pounds.ArchMicrobiollTl： 73-80,公众可从清华大学获得，该质粒中含有来源于罗氏真养杆菌Ralstoniaeutropha的 P皿合成基因地aC2基因、目-丽基硫解酶化aA和NADPH依赖的己醜己醜辅酶A还原酶 phaB。
[0157] 将上述2制备的表达载体ptkOl和地HR68用电击转化法同时转入到上述1获得 的皿eB敲除的重组菌EscherichiacoliJM109SGΔmreB中，获得重组菌A,为敲除皿eB 且质粒过表达皿eB和sulA基因；
[0158] 将上述2获得的表达载体ptkOl和地HR68用电击转化法同时转入到Escherichia coliJM109SG中，得到对照菌E.coliJM109SG(ptkOl，地皿68)，质粒过表达mreB和sulA基 因；
[0159] 将上述2获得的表达载体pxrOl和地HR68用电击转化法同时转入到 E.coliJM109SG中，获得重组菌B，质粒过表达皿eB基因。
[0160] 将步骤二获得的P沈VA341-Lacr-Ptrc-MinCD接合转化入盐单胞菌 TD08 (Fu,X. -Z.etal.DevelopmentofHalomonasTDOlasahostforopenproduction ofchemicals.Met油olicengineerings], 78-91(2014).公众可从清华大学获得），得到重 组菌株TD08 (pSEVA341-Lacr-Ptrc-MinCD)。
[016。 将P沈VA341接合转化入盐单胞菌TD08,得到对照菌株TD08 (PSEVA341)。
[0162] 分别将重组菌A、B涂布于LB-Amp，Km的固体培养平板上，重组菌A在3(TC培养12 小时，重组菌B在37°C培养12小时；分别挑取在LB-Amp，Km固体培养平板上长出的单克隆， 将其接种到LB-Amp，Km液体培养基中，重组菌A在3(TC、200巧m下摇床培养12小时，重组 菌B在37°C、200巧m下摇床培养12小时。
[0163] 重组菌A提取质粒用Bglll单酶切，得到6.8化和8. 1化的片段，证明ptkOl和 地HR68已经被成功转入到皿eB敲除的重组菌EscherichiacoliJM109SGΔ皿eB中，命 名为；EscherichiacoliJM109SGA皿eB(ptk01，地HR68)(图 1)，其为敲除Escherichia coliJM109SG基因组的mreB基因，且通过质粒ptkOl将mreB基因和sulA基因与质粒 地HR68共同导入E.coliJM109SG中得到的重组菌；
[0164] 重组菌B提取质粒用Ndel单酶切，得到3. 5化、8. 1化的片段，证明pxrOl和地HR68 已经被成功转入到E.coliJ1109SG中，命名为EscherichiacoliJM109SG(阳rOl，地HR68), 其为将mreB基因通过质粒pxrOl与质粒地HR68共同导入E.coliJM109SG中得到的重组 菌。
[0165]将地HR68转入E.coliJM109SG得到EscherichiacoliJM109SG(地HR68)，提取质 粒并用Bglll酶切验证，得到8.1化的片段，证明为阳性。
[0166]二、工程菌EscherichiacoliJM109SGΔ皿eB(ptkOl,地HR68)、E.coli JM109SG(pxr01，地HR68)和TD08(p沈VA：Ml-Lacr-Ptrc-MinCD)提高内含物产量
[0167]A、工程菌Escherichia coliJM109SGΔ皿eB(ptkOl,地HR68)、E. coli JM109SG(pxr01，地HR68)提高内含物产量
[0168]1、LB培养基条件下摇瓶培养P皿产量检测
[0169] 1)P皿产量检测
[0170]表达工程菌E.coliJM109SG(地HR68)、E.coliJM109SG(ptk01，地HR68)、 E.coliJM109SGAmreB(ptk01，pBHR68)分别用LB培养基，在 30°C，200巧m过夜培养；然后 按5%接种量（v/v)，分别接种至50mL的含葡萄糖的LB培养基（含；5g/L酵母提取物，10g/ L蛋白腺，lOg/L化C1，20g/L葡萄糖，其余为水，pH7. 0-7. 2)，3(TC，200巧m，摇瓶培养48小 时，得到菌液，经离必、水洗、冰干后得到干细胞待测样品，每个菌种设置Η组平行。运用气 相色谱仪（GC，Hewlett-Packardmodel6890)验证细胞中均聚物的积累。运用液相色谱仪 (HPLC,SpectroSYSTEM,ThermoSeparationProducts,USA)检测葡萄糖的消耗。
[0171] 液相检测色谱柱为Bio-rad公司有机酸柱，AninexHPX-87XIonExclusion Column(300X7.8mm)。流动相为5mMH2SO4,流速为0. 5ml/min。进样量为10μ1。检测器 使用美国S阳CTRASYSTEM公司的RI-150示差检测器。
[017引样品检测：取1. 5ml菌液，10000巧m离必后取上清液，用0. 45mm滤膜过滤后作为 色谱的样品。
[0173] 标准曲线测定；葡萄糖水溶液。将葡萄糖的标准样品稀释不同倍数，W0. 5ml/min 的流速，通过HPLC检测，并绘制标准曲线。
[0174] 葡萄糖标样的出峰时间为第11. 051min〇
[0175] 结果为各组葡萄糖几乎全部用完，根据标样定量检测出各组培养基中葡萄糖的浓 度，用于监测培养基中碳源的变化从而适当的补加碳源。
[0176] 气相检测3-居基了酸均聚物的方法：
[0177] 设定炉温为8(TC，进样器温度为20(TC，检测器温度为22(TC，柱头压力为 0. 25Mpa，程序升温条件为；8(TC停留1. 5分钟，W3(TC/min的速度升温至14(TC，接着W 4(TC/min的速度升温至22(TC并在此温度保持0. 5分钟。样品的进样量为1μ1，使用安捷 伦公司生产的微量进样器。
[017引气相样品准备：取40-60mg待测样品的干细胞（菌液1000化pm,10分钟条件下离 必，所得细胞沉淀水洗一次之后，冰干，得到干细胞，均聚物产于细胞中），加2ml氯仿，2ml 醋化液（纯甲醇中含3% (v/v)的浓硫酸及2g/L苯甲酸作内标）于醋化管中，加盖密封后 于100下加热4小时。冷却后加入1ml蒸傭水，充分振荡后静置，待氯仿相与水相完全分层 后，取下层氯仿相1μ1注入气相色谱仪（HP公司化wlett化ckard6890)中进行色谱分析。 依照HP公司Hewlett化ckard6890气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。
[0179] 标准样品准备：取10-20mg的3 -居基了酸3皿(sigma-al化ich，产品货号： 363502-10G)水溶液于醋化管中，加2ml氯仿，2ml醋化液，加盖密封后在10(TC进行醋化。 在本实施例中的气相检测条件下，标准样品在第2.2分钟有明显出峰，表征醋化样品中的 3-居基了酸。
[0180]W标准样品为对照，如果待测细胞的醋化样品（待测样品）在2.2分钟也有明显 的出峰，且无其它特异峰出现，说明待测细胞的醋化样品有且仅有3皿单体。因为在干细胞 中3皿只能W聚合物的形式存在，送样的结果即证明了均聚物的产生。
[01引]结果为E.coliJM109SGΔ皿eB(ptk01,地HR68)、E.coliJM109SG(ptk01， 地HR68)、E.coliJM109SG(地HR68)的干细胞在2. 2分钟也有明显的出峰，并且没有其它特 异出峰，说明能够生产均聚物。
[0182] 通过分析气相检测到的出峰面积和样品量，可得到干细胞中含有均聚物的比重 (wt% )，及每L培养体系中能够生产的均聚物或共聚物的浓度（g/L)，具体结果见表1所 /J、