人睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，具体涉及人睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途。
【背景技术】
[0002]迟发性性腺功能减退症(L0H)是指中老年男性随着年龄增长，睾丸间质细胞数量减少和功能衰退而导致体内睾酮水平逐渐降低，其严重影响生活质量。目前，L0H的主要治疗方法是雄激素替代疗法，但是该疗法存在补充剂量难以掌握、无法模拟生理性睾酮的分泌特点、需长期用药等缺点。随着社会人口老龄化进程加速，L0H患者日益增加，因此，探索使L0H患者的雄激素水平恢复到正常的治疗方法，成为迫切需要解决的重大科学问题。
[0003]睾丸间质干细胞(stem Leydig cells, SLCs)具有自我更新能力，是分化为睾丸间质细胞(Leydig cells, LCs)的直接细胞来源，是理想的L0H干细胞治疗的种子细胞。目前对SLCs的研究甚少，局限在小鼠、大鼠等动物睾丸中分离出SLCs。传统上大部分获得睾丸间质细胞的方法采用密度梯度离心法(Ge RS, Dong Q, Sottas CM, PapadopoulosV, Zirkin BR, Hardy MP.1n search of rat stem Leydig cells:1dentificat1n, isolat1n, and lineage-specific development.Proc Natl Acad Sci U S A2006 ;103:2719-2724 ;Stanley E,Lin CY, Jin S, Liu J,Sottas CM, Ge R, et al.1dentificat1n, proliferat1n, and differentiat1n of adult Leydig stem cells.Endocrinology 2012 ；153:5002-5010.)，等密度区带离心主要用于密度不同的样品组分的分离和纯化，这种方法对细胞要求较高，不仅对离心机和离心转子有要求，并对分离活细胞的介质有较高要求，例如:1)能产生密度梯度，且密度高时粘度不高；2)pH中性或易调为中性；3)浓度大时渗透压不大。其主要缺点是等密度区带离心法是一种平衡离心法，达到平衡时间很长，通常要十几甚至几十个小时，且细胞丢失过多，故而限制了它的普及使用。另外某些样品暴露于高浓度的梯度液中，可能引起损伤。最近有研究报道，利用nestin-GFP转基因小鼠，流式细胞分选获得的SLCs分选效率高，具有较强的自我更新和多向分化潜能，并在移植动物体内可分化为成熟的LCs，促进睾酮的分泌和精子发生，为睾酮替代治疗提供了重要的科学依据(Jiang ΜΗ, Cai B, Tuo Y, et al.Characterizat1n of Nestin-positive stemLeydig cells as a potential source for the treatment of testicular Leydig celldysfunct1n.Cell Res.2014.24(12): 1466-85)，但是由于nestin是细胞内蛋白，因此限制了其临床应用。此外，对于人睾丸间质干细胞(human stem Leydig cells, hSLCs)的分离与培养目前研究未见相关报道。
[0004]⑶51又称为整合素蛋白α V，是整合素蛋白超家族中的一员，其实质为异质二聚体整合膜蛋白由α链和β链两部分构成。进一步可细分为ανβ?，α V β 3, α ν β 5,ανβ6和ανβ8共5个亚型。在调控胚胎器官形成，血管生成，血管通透性，癌症演进，上皮组织的炎症及纤维化中发挥重要作用要作用。有研究报道，CD51广泛分布于牙周韧带，人脐带血及华通氏胶中MSC样细胞的表面。同时，也发现CD51存在于大部分人骨髓MSC细胞的表面，认为是MSC的标志物(Pinho S, Lacombe J, Hanoun M etal.PDGFRalpha and CD51mark human nestin+sphere-forming mesenchymal stem cellscapable of hematopoietic progenitor cell expans1n.The Journal of experimentalmedicine2013 ；210:1351-1367)。本实验室通过流式分析和免疫染色等方法证明了在小鼠睾丸nestin+SLC表达⑶51，并可能为小鼠睾丸SLC的标志物。然而，目前尚未有⑶51在人睾丸中表达的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种人睾丸间质干细胞(human leydig stem cells, hSLCs)的分离及培养方法，为性腺功能低下的病人尤其是L0H病人提供新的更加接近生理情况的补充睾酮的方案。
[0006]本发明以CD51作为细胞标志物分离人睾丸间质干细胞，获得CD51+的人睾丸间质干细胞。具体步骤为:将组织活检分离的梗阻性无精症病人睾丸标本用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液以去除组织团块，得到人睾丸细胞；通过CD51流式抗体标记人睾丸细胞，利用流式细胞仪进行分选，收集表达CD51的细胞，从而分离出CD51阳性的人睾丸间质干细胞。
[0007]分离CD51阳性的人睾丸间质干细胞的方法的具体步骤如下:
[0008](1)取下人睾丸组织活检标本后，立即置于含有15 μ g/ml庆大霉素的冰DMEM/F12培养基中。2小时内处理组织:小剪刀剪碎组织部分，随后放入lmg/ml的IV型胶原酶溶液，于37°C、5% C02条件下孵育30min，加入3倍体积的PBS稀释胶原酶的活性，1500rpm离心5min ;弃去上清液加入15ml PBS,并用孔径为40 μ m的尼龙网过滤细胞悬液，去除未消化的曲细精管，收集单细胞，以1500rpm离心5min，得到人睾丸细胞；
[0009](2)进行⑶51抗体标记。取上述人睾丸细胞悬液与荧光标记的⑶51抗体混合，两者体积比为⑶51抗体:人睾丸细胞悬液为1:200，4°C微旋孵育30分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，同时另取上述人睾丸细胞悬液与IgG进行孵育作为阴性对照，经流式分选收集荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出CD51阳性人睾丸间质干细胞(CD51+hSLCs)。
[0010]本发明还在DMEM/F12基础培养基的基础上进行改良，优化了传代细胞培养基，以培养分离得到的人睾丸间质干细胞，产生自我更新和增殖的细胞。将流式分选收集的CD51阳性细胞在原代培养基(具体为DMEM-F12培养基中加入5% FBS)中放置2小时，之后换为无血清传代细胞培养基。所述无血清传代细胞培养基具体为在DMEM-F12培养基中加入InM地塞米松、2ng/ml LIF、50ng/ml胰岛素、50ng/ml转铁蛋白、50pg/ml亚砸酸钠、5% (V/V)鸡胚提取物、1% (V/V)非必需氨基酸、2% (V/V)B27无血清添加剂、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBBo实验表明，将该培养基用于本发明所述的人睾丸间质干细胞的培养，细胞增殖效果非常好。
[0011]本发明对分离得到的CD51阳性细胞进行睾丸间质干细胞系(CD51+hSLCs)及干细胞相关蛋白表达的检测，从分子水平分析CD51+hSLCs的分子生物学特点，进一步分析该细胞的自我更新和多向分化能力，从而对该种干细胞进行鉴定。结果表明，CD51+hSLCs呈克隆球样生长。培养的CD51+hSLCs表达PDGFR- α、P75、SSEA-4、LIFR，但是不表达3 β -HSD、LHR等。CD51+hSLCs细胞具有自我更新能力。分化实验结果表明，在特定的诱导分化条件下，CD51+hSLCs可分化为脂肪细胞、成骨细胞；也可以分化为睾丸间质细胞，并分泌睾酮。
[0012]本发明将分离的CD51+hSLCs移植到去除睾丸间质细胞的大鼠动物模型(应用大鼠睾丸间质细胞的特异性凋亡诱导剂二甲磺酸乙烷?DS)建立的睾丸间质细胞的凋亡模型)，评价该干细胞在睾丸微环境中的作用。结果发现，该干细胞移植后可以提高血清睾酮的浓度。因此，本发明的方法得到的CD51+hSLCs可以用于制备治疗人睾酮水平低下相关疾病的药物。
[0013]本发明首次分离出⑶51阳性的人睾丸间质干细胞(⑶51+hSLCs)并对其进行培养使其增殖。本发明的CD51+hSLCs能够在体外特定诱导培养基中，逐渐获得睾丸间质干细胞的markers和睾酮分泌的能力。将本发明的⑶51+hSLCs移植到用EDS消除了睾丸间质细胞的大鼠模型中，CD51+hSLCs能够分化为睾丸间质细胞，并且能够提高模型动物的血清睾酮水平。
【附图说明】
[0014]图1是CD51+hSLCs体外培养的培养图。
[0015]图2是⑶51+hSLCs睾丸间质干细胞相关标志物表达图。
[0016]图3是培养的CD51+人睾丸间质干细胞从单个细胞增长到克隆球的白光观察图。
[0017]图4是培养的CD51+hSLCs在体外向成骨细胞分化(A)、向脂肪细胞分化⑶的图。
[0018]图5是⑶51+hSLCs向体外睾丸间质细胞分化图。
[0019]图6是⑶51+hSLCs体外培养条件下分泌睾酮的量。
[0020]图7是⑶51+hSLCs移植到EDS模型大鼠10天后，血清睾酮水平示意图。其中EDS(+)/saline(+)为模型组，EDS (+)/Cell (+)为细胞组。
【具体实施方式】
[0021]可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。
[0022]本发明的一方面提供了一种人睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于:
[0023](1)将人睾丸组织活检样品用IV型胶原酶消化，过滤消化后的细胞悬液，得到人睾丸细胞悬液；
[0024](2)用荧光标记的CD51抗体标记步骤(1)获得的人睾丸细胞，利用流式细胞仪进行分选，收集表达CD51的细胞，从而分离出CD51阳性的人睾丸间质干细胞。
[0025]在一个具体的实施方案中，上述步骤(1)具体为将人睾丸组织活检样品放置于含有15 μ g/ml庆大霉素的冰DMEM/F12培养基中；2小时内处理组织:剪碎组织，随后放入lmg/ml IV型胶原酶溶液，于37°C、5 % C02条件下孵育30min，加入3倍体积的PBS稀释胶原酶，1500rpm离心5min ;弃去上清液，入15ml PBS，并用孔径为40 μ m的尼龙网过滤细胞悬液，收集的滤液以1500rpm离心5min，得到人睾丸细胞
[0026]在一个具体的实施方案中，所述IV型胶原酶溶液中含有少量的DNase酶(450U)。
[0027]在一个具体的实施方案中，上述步骤⑵中所述“收集表达⑶51的细胞”是收集