一种小桐子蔗糖转运蛋白同源基因的克隆方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体设及一种小桐子薦糖转运蛋白 同源基因（JcSUTl，JcSUT3，JcSUT4)的克隆方法。
【背景技术】
[0002] 小桐子（Jatro地a州；Teas)又名麻疯树，为大戟科麻疯树属植物，是一种重要的生 物能源树种。众所周知，绿色植物是通过光合作用合成有机物并W碳水化合物的形式运输 到各个组织和器官从而完成其生长发育的整个生命过程。薦糖作为其运输的主要形式在薦 糖转运蛋白的作用下从源组织转运到初皮部中，然后沿着初皮部长距离运输，最终卸载到 植物的库细胞中。总而言之，薦糖对植物生长和发育起着至关重要的作用。小桐子虽然属 于高光效植物，但是其种实产量很低，特别是种子油含量参差不齐，运极大地限制了生物柴 油产业化的应用。因此，克隆编码小桐子薦糖转运蛋白的基因，对进一步阐明小桐子薦糖运 输过程和作用机制的W及产量性状的遗传改良具有重要的理论意义。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种小桐子薦糖转 运蛋白同源基因（JcSUTl，JcSUT3，JcSUT4)的克隆方法。
[0004] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0005] -种小桐子薦糖转运蛋白同源基因的克隆方法，包括W下操作步骤：应用如SEQ IDN0:1所示的引物F，如SEQIDN0:2所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUTl;应用如 SEQIDN0:3所示的引物F，如SEQIDN0:4所示的引物R，进行反转录PCR扩增JcSUT3; 应用如SEQIDNO:5所示的引物F，如SEQIDNO:6所示的引物R，进行反转录PCR扩增 JcSUT4。
[0006] 所述PCR的反应条件是：94°C预变性2min，98°C变性10sec，55°C退火30sec，68°C 延伸2min，将变性、退火和延伸Ξ个步骤重复35个循环；循环结束后，68°C再延伸7min，4°C 冷却lOmin;反应后加 3μ1dNTPs、0. 5μ1Taq酶，72°C反应 20min。
[0007] 所述PCR的体系是：
[0008] Buffbr 25μ1 浓巧为2.5nmol·L-1 的dNTP?ΟμΙ c.DNA第一链模板 1μ1 Primer-FI5μ! Primer-R 1.5μ1 KODFX 1μ! ddll]0 9μΙ。
[0009] 所述cDNA第一链模板是按照W下方法合成：
[0010] (1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液：
[0011] 5XIScriptreactionmix 4μ1
[0012]含 1μgRNA的溶液 Xμ1
[0013]IScriptreversetranscriptase 1μ1
[0014] Nuclease-free water补齐至 20μ1 ;所述X《15 ;
[0015] (2)将步骤（1)所得溶液吹打均匀，置于PCR中，WW下条件进行反转录扩增： 25°C反转录引物和模板RNA退火结合5min，42°C延伸30min，85°C保持5min把合成的cDNA 和RNA变性打开得到cDNA，然后4°C恒溫保存。
[0016] 所述RNA是按照W下提取方法得到：
[0017] (1)收集lOOmg冰冻的小桐子样品在离屯、管中，在组织解冻之前，加入500μ1的 BufferR化和β-琉基乙醇的混合液，满旋震荡30s，使样品充分混匀；所述BufferR化和 β-琉基乙醇的体积比为1 :50 ;
[0018] (2) 55°C金属浴1~3min;接着室溫下W速度14000巧m离屯、5min;
[001引 做将上清液转移到含有曲NA过滤柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度 14000巧m离屯、2min;
[0020] (4)加入相等体积的BufferRCB到下清液中，并通过移液器吸打混合液5~10 次，使之充分混匀；
[0021] (5)将步骤（4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一个化BincfRNAMin的过滤 柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度1000化pm离屯、Imin;离屯、后弃滤液，并将过滤柱放 回到收集管中；
[002引 （6)将步骤（4)中剩余混合液加入到过滤柱中，并在室溫下W速度1000化pm离屯、 Imin;离屯、后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
[0023] (7)加入300μ1RWCWashBuffer至过滤柱，在室溫下W速度10000巧m离屯、 Imin；
[0024] 做弃滤液，加入75μ1Dnasedigestion反应液至过滤柱中央滤膜上；所述 Dnasedigestion是将OBIDnaselDigestionBuffer73. 5μ1 和RNase-freeDnaseI 1. 5μ1颠倒混匀而成的混合液；
[00幼 （9)室溫下，静置15min;
[002引 （10)将过滤柱放置于干净的2ml收集管中，加入400μ1RWCWashBuffer于室溫 下静置5min;然后在室溫下W速度1000化pm离屯、Imin;
[0027] (11)弃滤液，将过滤柱放回到收集管内，并加入500μ1RNAWashBufferII;然 后在室溫下W速度10000巧m离屯、Imin;所述RNAWashBufferII在使用前用48ml的无水 乙醇稀释；
[002引重复步骤（11)操作一次，然后空转2min;
[0029] (13)将过滤柱转移至纯净的1. 5ml离屯、管内，加入40μ1DEPC水溶解RNA;
[0030] (14)室溫下，静置 5min;
[0031] (15)室溫下，10000巧m离屯、Imin，即可得到RNA，用核酸快速测定仪和琼脂糖凝胶 电泳测浓度与纯度。
[0032] -种由权利要求1所述的克隆方法获得的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUTl， 所述的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUTl的核巧酸基因序列如SEQIDN0:7所示。具 体女曰下；Seql[organism=JatrophacurcasL][clone= 1590bp]sucerosetransporter IcDNA,completeCDS
[0033]
[0034] -种由权利要求1所述的克隆方法获得的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUT3， 其特征在于：，所述的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUT3的核巧酸基因序列如SEQID NO:8 所示。具体如下：Seq2[organism=JatrophacurcasL][clone= 1848bp]suce;rose transporter3cDNA,completeCDS
[0035]
[0036] 一种小桐子薦糖转运蛋白同源基因JcSUT4,其特征在于：由权利要求1所述的 克隆方法获得，所述的小桐子薦糖转运蛋白同源基因JCSUT4的核巧酸基因序列如SEQID NO:9 所不D具体如下：Seq3[organism二JatrophacurcasL][clone二 1503bp]sucerose transporter4cDNA，completeCDS
[0037]
[0038]与现有技术相比，本发明具有W下优点及有益效果：本发明设计的特异引物和特 定的PCR扩增步骤能够有效的克隆出小桐子JcSUTl、JCSUT3、JCSUT4的CDS序列。
【附图说明】
[0039] 图1是小桐子JcSUTl的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUTl的cDNA PCR产物条带。
[0040] 图2是小桐子JcSUT3的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT3的cDNA PCR产物条带。
[0041] 图3是小桐子JcSUT4的cDNAPCR产物电泳图谱，其中1、2均为JcSUT4的cDNA PCR产物条带。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]实施例 1 小桐子JcSUTl,JcSUT3,JcSUT4 的cDNA克隆。
[0044] 1、小桐子RNA提取方法：使用OMEGA公司生产的植物RNA提取试剂盒。
[0045] (1)收集lOOmg冰冻的小桐子样品在离屯、管中，在组织解冻之前，加入500μ1的 BufferR化和β-琉基乙醇的混合液，满旋震荡30s，使样品充分混匀；所述BufferR化和β-琉基乙醇的体积比为1 :50 ;
[0046] (2) 55°C金属浴1~3min ;接着室溫下W速度14000巧m离屯、5min ;
[0047] 0)将上清液转移到含有曲ΝΑ过滤柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度 14000巧m离屯、2min;
[0048] (4)加入相等体积的Buffer RCB到下清液中，并通过移液器吸打混合液5~10 次，使之充分混匀；
[0049] (5)将步骤（4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一个化BincfRNAMin的过滤 柱的2ml收集管中，并在室溫下W速度1000化pm离屯、Imin;离屯、后弃滤液，并将过滤柱放 回到收集管中；
[0050] (6)将步骤（4)中剩余混合液加入到过滤柱中，并在室溫下W速度1000化pm离屯、 Imin;离屯、后弃滤液，并将过滤柱放回到收集管中；
[0051] (7)加入300μ1RWCWashBuffer至过滤柱，在室溫下W速度10000巧m离屯、 Imin；
[0052] (8)弃滤液，加入75μ1化ase digestion反应液至过滤柱中央滤膜上；所述 Dnase digestion是将OBI Dnasel Digestion Buffer 73. 5μ1和RNase-free Dnase I 1. 5μ1颠倒混匀而成的混合液；
[00閲 （9)室溫下，静置ISmin