检测人类cyp2c19基因多态性的引物对、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测领域，特别是设及一种检测人类CYP2C19基因多态性的引物 对、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶， 在肝脏中有很多表达，国内常用的处方药物中，大部分由P450酶负责代谢，而P450酶 负责代谢的药物中，12%由CYP2C19代谢。在中国人中，CYP2C19基因主要有Ξ种类 型：CYP2C19*1(野生型[*1/*1])，CYP2C19巧（突变型，681位单碱基变异G-A[*l/巧， 巧/*2])，CYP2C19*3(突变型，636位单碱基G-A[*l/*3，*3/*3])。从药物代谢方面来说， 其等位基因表型则有Ξ种：快代射型EM(*1/*1)，中间代射型*1/*3)，慢代射型 (*2/巧，*2/*3, *3/*3)，其中CYP2C19巧、CYP2C19*3,可W使CYP2C19酶失活，而且运两个等 位基因在东方人中可解释超过99%的弱代谢表型。
[0003] CYP2C19基因*2 (G681A)位点、*3 (G636A)位点的单核巧酸多态性（SN巧均与 CYP2C19酶代谢药物的疗效相关。氯化格雷作为血小板受体P2Y12抑制剂，广泛应用于急性 冠状动脉综合征（AC巧和经皮冠状动脉介入治疗（PCI)后患者的抗血小板治疗。CYP2C19 基因多态性对氯化格雷的代谢转化产生关键性影响，CYP2C19巧或*3等位基因的存在导 致CYP2C19酶活降低，氯化格雷活性代谢产物减少，造成血小板表面受体异常、血小板反应 通路异常等情况，从而增加不良屯、血管事件发生几率。2010年，美国食品药品监督管理局 (FDA)要求在氯化格雷说明书中加入黑框警告，指出氯化格雷代谢不良者不能有效地转化 氯化格雷为活性形式，药物疗效因而显著降低，提醒医生应对患者的CYP2C19基因型进行 检测，据此合理调整给药剂量。 阳004] 质子累抑制剂（protonpumpinhibitors,PPIs)是目前最有效的胃酸分泌抑制剂 和抗溃瘍药物。CYP2C19基因多态性导致不同基因型的人群对PPI的代谢存在个体差异。 若患者携带CYP2C19巧或*3等位基因，其CYP2C19酶活性较低，对PPI代谢能力弱，药物容 易在体内积累，治愈率较好；反之，则对PPI代谢能力强，易造成疗效不佳情况。 阳〇化]西献普兰是一类5-径色胺摄取抑制剂（SSRI)，在临床上有较强的抗抑郁作用，常 用在抑郁症的急性期和长期维持治疗。多项研究表明：弱代谢型（PM)患者需要更低剂量的 西献普兰治疗。2013年，国家食品药品监督管理局发表了关于西献普兰及相关制剂说明书 的通知，要求药品说明书中列出对CYP2C19弱代谢（PM)患者的建议使用剂量。
[0006] 目前，对基因多态性的检测分析技术方法主要包括：ARMS巧光PCR法，基因测序、 限制性片段长度多态性方法（RFLP)、基因忍片等方法。运些方法都有各自的优点和缺陷，尚 有待改进和标准化。
[0007] 1、ARMS巧光PCR法：扩增阻碍突变系统（Amplificationrefractorymutation system,ARM巧利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DM互补才能有效扩增的原理， 设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才 能出现PCR扩增带，从而检测出基因突变。
[0008] 2、直接测序：Sanger测序法因为可W读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检 测基因突变的金标准方法。缺点是测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高， 检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，较难形成标准化操 作、适合临床单位应用的体外诊断产品。
[0009] 3、限制性片段长度多态性方法（RFLP):该方法成本低，对检测设备要求低，突变 基因的检出限在5~10%。但是，劳动强度稍大、需要专业的技术人员、不适于高通量检测 和大规模临床应用。
[0010] 4、基因忍片法：该方法是将探针固定于支持物上，如玻片或膜，通过PCR方法扩增 出祀基因，再通过杂交手段进行忍片杂交，应用仪器进行结果判读。该方法可W进行高密度 基因检测，但成本高、操作繁琐、检测流程相对较长，在市场推广上受到一定限制。
[0011] 目前，还有待于开发一种操作简单快捷、特异性高、具有抗污染的检测人类 CYP2C19基因多态性的试剂盒。
【发明内容】
[0012] 基于此，本发明的一个目的在于提供一种特异性高的检测人类CYP2C19基因多态 性的试剂盒，该试剂盒能实现对CYP2C19基因*2(G681A)位点、*3(G636A)位点的基因型的 单独或者并行检测。
[0013] 实现上述目的的技术方案如下：
[0014] 一种用于检测人类CYP2C19基因多态性的试剂盒，包括有：针对CYP2C19基 因G681A位点的扩增引物和碱基组成如SEQIDN0:3所示的巧光检测探针、和/或针对 CYP2C19基因G636A位点的扩增引物和碱基组成如SEQIDN0:6所示的巧光检测探针。
[0015] 在其中一个实施例中，所述针对CYP2C19基因G681A位点的扩增引物的碱基组成 如沈QIDNO: 1和沈QIDNO:2所示。
[0016] 在其中一个实施例中，所述针对CYP2C19基因G636A位点的扩增引物的碱基组成 如沈QIDNO:4和沈QIDNO:5所示。
[0017] 在其中一个实施例中，所述试剂盒包括有：针对CYP2C19基因G68ΙΑ位点的扩增引 物SEQIDΝ0:1和SEQIDN0:2W及碱基组成如SEQID^:3所示的巧光检测探针、和/ 或针对CYP2C19基因G636A位点的扩增引物SEQIDN0:4和SEQIDN0:5W及碱基组成如 SEQIDN0:6所示的巧光检测探针。
[0018] 在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有反应液，所述扩增引物在相应反应液 中的浓度为：每种上游引物的浓度为0. 05-0. 1μM，每种下游引物的浓度为0. 1-0. 5μM。
[0019] 在其中一个实施例中，每种检测探针在所述反应液中的浓度为：0. 05-0. 5μΜ。
[0020] 在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有UNG酶。
[0021] 本发明的另一目的为提供用于检测人类CYP2C19基因多态性的检测探针。
[0022] 具体技术方案如下：
[0023] 一种用于检测人类CYP2C19基因多态性的检测探针，包括有：针对CYP2C19基因 G681A位点的碱基组成如SEQIDN0:3所示的巧光检测探针、和/或针对CYP2C19基因 G636A位点的碱基组成如SEQIDN0:6所示的巧光检测探针。
[0024] 本发明的另一目的为提供用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物。 阳0巧]具体技术方案如下：
[0026] 一种用于检测人类CYP2C19基因多态性的引物，包括有：针对CYP2C19基因G681A 位点的碱基组成如SEQIDN0:1和SEQIDN0:2所示的引物、和/或针对CYP2C19基因 06364位点的碱基组成如569 10^:4和569 10^:5所示的引物。
[0027] 本发明的优点及有益效果如下：
[0028] (1)本发明经过大量实验从众多的引物中，挑出了具有高特异性的引物、巧光探 针，再进一步优化检测体系，可实现高特异性地单独或者同步检测CYP2C19基因巧(G681A) 位点、*3(G636A)位点的基因型；其次，还具有检测线性广的优点，Κ25μΙ检测体系可检测 2ng-600ng人基因组DNA;而且，准确性高，检测结果与金标准测序方法100%-致。
[0029] 似闭管操作，检测速度快，检测过程只需90分钟即可完成。
[0030] 做抗污染，试剂盒中含有UNG酶，可W消除由于PCR产物导致的污染。
【附图说明】
[0031] 图la为实施例2中CYP2C19巧野生型样本检测结果示意图；
[0032] 图化为实施例2中CYP2C19巧突变型样本检测结果示意图；
[0033] 图Ic为实施例2中CYP2C19巧杂合型样本检测结果示意图；
[0034] 图Id为实施例2中CYP2C19巧杂合型样本测序结果示意图； 阳03引 图le、图If为实施例2中CYP2C19巧引物为SEQIDN0:7-8的检测结果图；
[0036] 图Ig、图比为实施例2中CYP2C19巧引物为SEQIDN0:9-10的检测结果图；
[0037] 图li、图Ij为实施例2中CYP2C19巧引物为SEQIDN0:ll-12的检测结果图； 阳03引图2a为实施例3中CYP2C19*3野生型样本检测结果示意图；
[0039] 图化为实施例3中CYP2C19*3突变型样本检测结果示意图； W40] 图2c为实施例3中CYP2C19*3杂合型样本检测结果示意图；
[0041] 图2d为实施例3中CYP2C19*3杂合型样本测序结果示意图； 阳0创 图2e、图2f为实施例3中CYP2C19*3引物为沈QIDNO: 13-14的检测结果图； 阳0创图2g为实施例3中CYP2C19*3引物为SEQ ID NO: 15-16的检测结果图； W44] 图化为实施例3中CYP2C19*3引物为SEQIDNO: 17-18的检测结果图。
【具体实施方式】
[0045] 本发明采用的具体技术原理是在每个检测祀点的PCR体系中，加入一对非等量的 特异性引物和一条覆盖SNP位点的巧光探针。首先通过不对称PCR扩增出含检测位点的单 链寡核巧酸祀序列，其后运行烙解曲线巧光采集程序。从低溫到高溫的烙解过程中，巧光探 针与单链祀序列形成的杂交产物从互补配对到解链变性，期间的巧光值变化记录为烙解曲 线。将烙解曲线对溫度作一阶负导数可获得杂交产物的烙解峰图，并计算出相应的烙点（Tm 值）。由于SNP位点的碱基变化不同，导致祀序列与探针的匹配程度不一，因此杂交产物的 溫度稳定性及烙解行为各有差异。若单链祀序列中只有1种等位基因，并与探针完全匹配， 则只有1个烙解峰，其Tm值较高；反之，单一烙解峰的Tm值较低；若祀序列含有2种等位基 因，则会出现2个烙解峰，Tm值分别与两种纯合等位基因的烙解峰的Tm值一致。通过对烙 解峰图的分析可对检测位点基因型进行判读。
[0046] W下结合【具体实施方式】对本发明做进一步的阐述。应理解，运些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件，例如Aambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarbor L油oratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到 的各种常用化学试剂，均为市售商品。
[0047] 除非另有定义