多重分型检测人巨细胞病毒(hcmv)的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物领域，尤其设及多重分型检测人巨细胞病毒（HCMV)的试剂盒及 其应用。
【背景技术】
[0002] 人巨细胞病毒（Human切tomegalovirus, HCMV),也称人瘤疹病毒5型，属于瘤疹 病毒科β亚科。HCMV感染在人群感染普遍，其抗体阳性率高达40%~100%。HCMV是一 种终身感染病毒，一经感染，人体宿主终身携带。在人体的感染过程中，分为原发感染、激活 感染和位于两者之间的潜伏感染。HCMV是一个弱致病因子，多W潜伏形式存在于人体多种 细胞中，在免疫系统正常的人体中，潜伏感染并不致病。但多种诱因均可使潜伏的病毒被激 活，从而引发明显的临床症状和严重危害。
[0003] HCMV感染在孕妇和婴幼儿W及免疫功能低下的人群如器官移植、艾滋病、恶性肿 瘤等则可导致包括致死在内的严重后果。妊娠期妇女由于其内分泌及免疫状态的改变而 更易发生HCMV的原发感染，也可使既往体内潜伏的病毒被激活，而发生激活感染，通过母 婴垂直传播给胎儿，导致死胎、早产、流产、智力低下、生长发育迟缓及多种崎形，严重者可 引起胎儿全身性感染综合征。HCMV感染在我国的育龄女性HCMV感染率高达95. 3%。孕妇 HCMV原发感染者，引起胎儿先天性感染的发病率高达40 %，先天性HCMV感染胎儿的死亡率 为10% -30%，存活者中90%W上可遗留不同程度的神经系统后遗症。此外，自身免疫病 病人，免疫抑制治疗，肝、肾、屯、脏等器官移植，化疗和放疗的肿瘤及骨髓移植，艾滋病人等 极易通过感染而发病，产生广泛的HCMV激活感染，引起活动性HCMV致病表现，如移植失败、 CMV相关肝炎甚至肝衰竭、视网膜炎、肺炎、大肠炎等。
[0004] 肥MV的浊基因编码浊糖蛋白，又称化55。浊基因虽高度保守，但在一定区域内 存在变异。在浊的裂解区（核巧酸2075-2390,氨基酸453-472)表现出序列的高度差异。 根据对临床HCMV病毒株的浊的裂解区进行基因扩增及序列分析可将HCMV划分为四个基 因型：HCMV-I、II、III、IV型。研究表明HCMV感染病人如感染多型W上的病毒，其疾病的 预后较单型感染更差。运对临床治疗与监测有重要意义。
[0005] 目前HCMV基因分型为的常用检测方法是利用聚合酶链式反应（PCR)，文献报道的 方法无一例外是分别设计四套引物与探针-分别实施4个PCR反应扩增相对应的基因型。 运种单个基因扩增的方法劳动强度大、检测通量低、工作效率低。
【发明内容】
[0006] 为了弥补W上领域的不足，本发明提供了一种多重分型检测人巨细胞病毒的试剂 盒。
[0007] 本发明所提供的多重分型检测人巨细胞病毒的试剂盒，包含W下引物序列和探针 序列： 阳00引用于HCMV病毒I型检测的引物序列是：
[0009] HCMV-PIFPI :5' -TAACACCATGGCTGACCGTTT-3';
[0010] HCMV-PIRPI :5' -CGTGGAACTTCTGCTACTCACA-3,； W11] 用于肥MV病毒I型检测的探针序列是： 阳01引 5' -巧光素-ACTGAACCGGATCGAGAGTGAGCAG-泽灭剂-3' ；和 阳01引用于HCMV病毒II、ΙΠ和IV型检测的引物序列是：
[0014] HCMV-P2FP2 :5> -TGAACTGCAGCTGAGCGT-3> ;
[0015] HCMV-P2RP2 :5' -GGTGTTCTGGCAAGGTATCAAGCAA-3';
[0016] 用于肥MV病毒II型检测的探针序列是：
[0017] 5' -巧光素-AGTGATATTCAGACTGGATCGATTGGCCAAAC-泽灭剂-3,； 阳01引用于HCMV病毒III型检测的探针序列是：
[0019] 5' -巧光素-CGTACTTCTCTTGGTTCTACGCGTGGAGTTCA-泽灭剂-3' ；
[0020] 用于HCMV病毒IV型检测的探针序列是：
[0021] 5'-巧光素-AACCAGAAGAAGTACAGATGGCACCAATGT-泽灭剂-3，。
[0022] 所述试剂盒还包含W下用于扩增阳性内参的引物序列和内参探针序列：
[0023] 用于扩增阳性内参的引物序列是：
[0024] HCMV-ICFP3 :5, -AGCTCGCCTCGTATCTGATG-3,； 阳0巧]HCMV-ICRP3 :5, -CTCCTGCGCCTCTGATTCAT-3,；
[0026] 内参换针序列是：
[0027]5,-巧光素-ACTCGAGAGCGTACTACATATCCGTCCT-泽灭剂-3,。 阳02引所述用于HCMV病毒I型检测的引物序列和所述用于HCMV病毒I型检测的探针序 列与所述用于HCMV病毒II型检测的引物序列和所述用于HCMV病毒II型检测的探针序列W 及所述用于扩增阳性内参的引物序列和探针序列独立包装；和
[0029] 所述用于HCMV病毒III型检测的引物序列和所述用于HCMV病毒III型检测的探针序 列与所述用于HCMV病毒IV型检测的引物序列和所述用于HCMV病毒IV型检测的探针序列W 及所述用于扩增阳性内参的引物序列和探针序列独立包装。
[0030] 所述多重分型检测人巨细胞病毒的试剂盒在制备检测人巨细胞病毒试剂中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0031] 所述多重分型检测人巨细胞病毒的试剂盒在制备对人巨细胞病毒进行基因分型 的试剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0032] 本发明所提供的多重分型检测人巨细胞病毒（HCMV)的试剂盒，具有高灵敏度、高 特异性、通量高等特点，可更好地满足临床精确快速诊断的需求。
【附图说明】 阳03引 图1为HCMV阳性标准品DNA系列稀释后扩增曲线分析结果。
[0034] 图2为肥MV阳性标准品DNA多重PCR扩增结果。 阳03引 图3为含有阳性内参的肥MV阳性标准品DNA多重PCR扩增结果，其中A为检测I、 II型及阳性内参反应管的扩增结果巧为检测III、IV型及阳性内参反应管的扩增结果。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1、多重分型检测人巨细胞病毒（HCMV)的试剂盒
[0037] 一、HCMV病毒四个基因型的浊基因裂解区序列的克隆
[0038] 按肥MV浊基因型I、II、III、IV每型共有序列分别人工合成基因，并将合成 产物连接到线形化质粒载体pGEMT-easy上进行克隆（委托北京奥科鼎盛公司合成），制 备成质粒利用pGEMT-easy通用测序引物验证所合成的序列正确，并利用微量分光光度 计测定质粒溶液浓度，所得到的质粒（统称为pGEMT-easy-CMV-浊，每一型克隆产物称为 pGEMT-eas}f-CMV-浊 1、pGEMT-eas}f-CMV-浊2、pGEMT-eas}f-CMV-浊3、pGEMT-eas}f-CMV-浊4) 作为HCMV病毒核酸分型的标准品。四型HCMV浊基因裂解区的插入序列见序列表序列12、 序列13、序列14、序列15。
[0039] 二、HCMV病毒核酸标准品的制备
[0040]将pGEMT-eas厂CMV-浊 4 型质粒（pGEMT-eas厂CMV-浊 1、pGEMT-eas厂CMV-浊2、 pGEMT-easy-CMV-浊3、pGEMT-easy-CMV-浊4)分别溶解到高压灭菌TE缓冲液中得到浓度 为l〇6copy/L的标准品。用灭菌TE缓冲液10倍连续稀释样品，每个PCR反应中加入10μL DNA，其每个PCR反应DM的拷贝数分别为：1〇6、1〇5、1〇4、1〇3、1〇2、1〇1。再将i〇ic〇py/l〇yL 的稀释物进行再稀释，其DM浓度为5拷贝/反应用于检测下限。
[0041] Ξ、HCMV病毒基因型的每型单独基因扩增检测 阳0创用于肥MV病毒基因分型检测的反应体系如下：10XPCRbuffer4yL，25mM MgClzA.8μL，lOmMdNTPs0.8μL，0.6M上游引物 1. 2μL，0.6M下游引物 1. 2μL，0. 3M探针 分别为0.6μLTaq酶抓/μL0. 4μL模板DNAIOμL其余为无核酸酶高纯水，终体积为 40μL。PCR扩增程序：95°C预变性2min;95°C变性15秒，60°C退火35秒，共45循环。在扩 增的同时实时采集FAM通道巧光信号。每个基因型检测PCR反应的引物、探针的组合如下 表所示（所有探针均在5'端FAM标记，3'端TAMRA标记）：
[0043]
W44]HCMV阳性标准品DNA系列稀释后实时扩增曲线结果见图1。阳性样品DNA系列稀 释倍数分别为1:1，1:10,1:1〇2,1: 1〇3,1:104,1: 1〇5;其对应Ct值如下表所示：
[0045]
[0046] 在所实验的HCMV模板的量的范围内，与巧光强度呈良好的线性关系。其可靠分型 检测下限为5拷贝/反应。
[0047] 四、多重（多联）分型检测HCMV病毒基因的方法