一种鉴定三带喙库蚊的实时荧光pcr引物和探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于昆虫鉴定技术领域。更具体地，设及一种用于海滨库蚊亚组中Ξ带瞭 库蚊鉴定的实时巧光PCR引物和探针及其应用。
【背景技术】
[0002] Ξ带瞭库蚊（化lex tritaeniorhynchus)属双翅目蚊科库蚊属库蚊亚属海滨库蚊 组海滨库蚊亚组，兼吸人和动物血，是流行性乙型脑炎的主要传播媒介。主要分布：国内除 新疆、西藏未见记录，分布于全国各地；国外分布于己基斯坦、印度、孟加拉国、斯里兰卡、细 甸、泰国、柬捕寨、越南、马来西亚、新加坡、印度尼西亚、菲律宾、日本、朝鲜、原苏联、中东、 东非等。
[0003] 海滨库蚊亚组蚊种包括：海滨库蚊、Ξ带瞭库蚊、白霜库蚊、环带库蚊、伪杂鱗库 蚊等，主要鉴定特征是翅无显著的黑白斑，但雄蚊尾器结构复杂，同一亚组形态特征极为接 近，鉴定难度大。Ξ带瞭库蚊是该亚组中具有重要医学意义的蚊种，主要鉴别特征：头顶竖 鱗暗而平齐；盾鱗暗栋呈花椒色；雄蚊触须第3节腹面有一行垂毛；雌蚊食窦甲齿纤维状； 后股末端黑环很窄；幼虫7-I分2芒枝；巧齿末端圆而有鍵。但受限于鉴定人员的经验积 累，仅凭形态学鉴定将Ξ带瞭库蚊与同一亚属蚊种进行鉴别需要有丰富经验；同时在捕获 不同发育阶段蚊种时，需培养至成虫进行鉴定，耗时较长；因采集工具等原因破坏标本的完 整性，给形态学鉴定带来更大困难。
[0004] 传统媒介蚊种形态学鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率 低等问题，随着分子生物学技术发展，基于DNA序列的物种分子鉴定技术应运而生，该技 术不受蚊虫发育阶段和性别限制，且只需一部分组织提取到足够量的核酸也可进行分类 鉴定，成为传统形态学鉴定的重要补充。蚊类分子鉴定技术主要包括W下几种方法：1、限 制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymo巧hism，RFLP)，结果稳定可 靠，重复性好，但灵敏度不高，不易自动化；2、随机扩增多态性DNA技术（RandomAmplified PolymorphicDM,RAPD)，技术简单，检测速度快，但实验的稳定性和重复性差；3、基于PCR 技术扩增基因组DNA限制性片段（amplifiedfragmentlengthpolymo;rphism)，兼具RAPD 与RFLP的优点，有较高稳定性，但对基因组制备纯度要求较高；4、DNA忍片技术，用于多种 分子标记检测，但设备和检测成本较高；5、DNA测序技术，结果直观可靠，可对传统分类有 疑问的类群或形态分类不能解决的问题进行分析探讨，也可对传统分类系统进行验证，但 也存在成本较高，耗时较长问题；6、PCR和巧光PCR技术，通过扩增特异性片段进行物种鉴 定，操作简便，成本较低，但找到适用的物种特异性DNA片段是难点。
[0005] LydiaA.化11等建立快速鉴定白纹伊蚊、埃及伊蚊和盾蚊伊蚊实时巧光PCR方 法，适用于蚊发育各个阶段的鉴定。与普通PCR相比，巧光PCR具有灵敏度高、特异性强、操 作简便、检测时间短等优点。同时巧光PCR的扩增和产物分析都在一封闭的管中进行，较之 传统的PCR方法大大减少了污染的几率，也具有较好的生物安全性。对于Ξ带瞭库蚊的巧 光PCR鉴定方法还未有报道。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服形态学鉴定海滨库蚊亚组蚊种鉴定难题，提供一 种一种快速、准确、特异性高、敏感性强的鉴定海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊的实时巧光PCR 方法和试剂盒。
[0007] 本发明的目的是提供上述实时巧光PCR的引物、MGB探针和检测方法。
[0008] 本发明上述目的通过W下技术方案实现：本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中 立带瞭库蚊鉴定的巧光PCR引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物化lex-F和下 游引物Culex-R，上游引物Culex-F由沈QIDNO. 1所示的序列，下游引物Culex-R由沈QID NO. 2所示的序列；所述探针为Tritaeniorhynchus-P探针，探针Tritaeniorhynchus-P由 沈QIDNO. 3所示的序列。巧光PCR上游引物化lex-F为沈QIDNO. 1所述的序列：5'-ΤΤ CAAGTAGTTTAGTAGAAAATGGAGC-3';巧光PCR下游引物Culex-R为沈QIDNO. 2 所述的序列： 5，-TGTAAAGAAAAAATAGCTAAATCAACTG-3，；巧光PCR探针Tritaeniorhynchus-P为沈QID NO. 3 所述的序列：FAM-5' -ACAGTTTATCCACCTCT-3' -MGB。
[0009] 所述探针Tritaeniorhynchus-P的5'端标记有FAM，3'端标记有非巧光泽灭基团 NFQ和MGB。
[0010] 本发明所述Ξ带瞭库蚊实时巧光PCR引物和探针在鉴定Ξ带瞭库蚊方面的应用。
[0011] 本发明所述Ξ带瞭库蚊实时巧光PCR引物和探针在制备Ξ带瞭库蚊鉴定试剂或 试剂盒中的应用。
[0012] 本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊鉴定的巧光PCR检测方法，其 PCR反应所用的引物和探针为权利要求1所述的引物和探针。
[001引本发明所述的PCR反应体系为：5μL模板DNA，10ymol/L上游引物Culex-F0. 625μL10μmol/L下游引物Culex-R0. 5μL10μ°Cmol/L巧光探针 Tritaeniorhynchus-P1. 25μL2X实时巧光PCR预混试剂和余量(1地20,共 25μL; PCR反应程序为：预变性94°C2min;94°C5s，58°C45s，共40个循环；58°C收集巧光信 号；根据扩增曲线、Ct值确定检测结果的阴性和阳性； 其中，实时巧光PCR预混试剂包含有实时巧光PCR反应所需要的DNA聚合酶、缓冲液和 dNTPo
[0014] 本发明所述的一种用于海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊鉴定的试剂盒，包括：权利要 求1或2所述的上游引物Qilex-F和下游引物Qilex-R，W及Tritaeniorhynchus-P探针， 实时巧光PCR反应体系中的DNA聚合酶、巧光PCR预混试剂，其中巧光PCR预混试剂包含有 实时巧光PCR反应所需要的缓冲液和dNTP。
[0015] 上述的单份25μL的实时巧光PCR反应体系使用的DM聚合酶量为0. 5~1U;单份 25μL的实时巧光PCR反应体系中各dNTP的终浓度为0. 2mmol/L。
[0016] 本发明公开一组用于海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊的实时巧光PCR引物和探 针，所述引物包手上游引物化lex-F和下游引物化lex-R，上游引物化lex-F的序列 如SEQIDNO. 1所示，下游引物化lex-R的序列如SEQIDNO. 2所示；所述探针为 Tritaeniorhynchus-P，MGB探针Tritaeniorhynchus-P的序列如沈QIDNO. 3 所示。
[0017] 其中所述探针Tritaeniorhynchus-P的5'端有报告巧光基团FAM，3'端为非巧光 泽灭基团和MGB修饰基团。
[0018] 上述鉴定海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊的实时巧光PCR引物和探针在鉴定Ξ带瞭 库蚊方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0019] 上述鉴定海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊的实时巧光PCR引物和探针在制备鉴定Ξ 带瞭库蚊试剂或试剂盒方面的应用也在本发明的保护范围之内。
[0020] 应用时，所述引物的优选退火溫度为58°C。
[0021] 本发明还W上述引物和探针建立了一种鉴定海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊的实时 巧光PCR方法。
[002引PCR反应体系为：5μL模板DNA，10μmol/L上游引物Culex-F0. 625μL，lOymol/L下游引物Qilex-R0. 5yL10ymol/L巧光探针Tritaeniorhynchus-P 1. 25μL2X实时巧光PCR预混试剂和余量(1地20,共25μL。
[0023]PCR反应程序：预变性 95°C30s;95°C5s，58°C45s，共 40 个循环。
[0024] 其中，所述实时巧光PCR预混试剂为商品化的宝生物(大连)有限公司的PremixEx TaqΤΜ(ProbeqPCR)试剂，包含有实时巧光PCR反应所需要的DM聚合酶、缓冲液和dNTP。 PCR反应程序根据所选用试剂不同可进行调整。
[00巧]另外，上述引物和探针构建的Ξ带瞭库蚊鉴定试剂盒也在本发明保护范围之内。
[0026] 在实际应用工作中，利用本发明所设计的引物和探针鉴定Ξ带瞭库蚊，大致工作 流程如下：首先提取待测样品DNA，再利用本发明设计的引物和探针或本发明建立的实时 巧光PCR方法进行检测。对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方法提取到 的样品DNA均可用于检测。
[0027] 本发明具有W下有益效果： 本发明公开了一组鉴定海滨库蚊亚组中Ξ带瞭库蚊的实时巧光PCR引物和探针，能快 速、准确地从海滨库蚊亚组蚊种中鉴定出重要医学媒介--Ξ带瞭库蚊，具有良好地特异性 和敏感性。
[0028] 1.结果可靠，敏感性高：本方法与Ξ带瞭库蚊形态学鉴定结果完全一致，对海滨 库蚊复合组其它蚊种无交叉反应，结果稳定可靠；可取单只蚊腿提取DNA进行检测，具有较 高的敏感性。
[0029] 2.操作简单、节省时间：本发明应用实时巧光PCR对蚊基因进行鉴定，操作简单， 整个实验过程在化内完成，适用于蚊生活史各个阶段鉴定，无需培养至成虫，节省时间。
[0030] 3.实验可由一般技术人员操作，无需媒介鉴定专家在场，可W快速地从海滨库蚊 亚组中鉴定出Ξ带瞭库蚊，解决海滨库蚊复合组蚊种鉴定难题，对残缺标本也可进行鉴定， 具有良好地应用前景。
【附图说明】
[003。图1是1~7号样本实时巧光PCR灵敏度试验结果图，图中：1 - 7依次 为 1XlO'copies/μL、IXl06copies/μL、1Xl05copies/μL、IXl04copies/μL、 1Xicfcopies/μL1Xl02copies/μLlOcopies/μL;8:阴性对照；9 :阳性对照。
[003引图2是实时巧光PCR重复性试验结果图，图中：1为阳性对照，2-9为 1Xicfcopies/μL质粒重复性试验，10为阴性对照。
[0033] 图3是实时巧光PCR特异性试验结果图。