合 抗体45分钟。接着，将细胞固定于PFA 4% 10分钟，然后用与FITC缀合的抗-CD24和与 APC度D)缀合的抗-CD44解育25分钟。洗涂后，用LSRII流式细胞仪度D)利用Flow化软 件度D)对细胞进行分析。在细胞系中测量至少1X104个事件。
[0239] 发现大约35 %的细胞表达0AcGD2 (8B6抗体），而仅有接近15 %的细胞表达GD2神 经节巧脂（14G2a抗体）。运样的不同表达在另一种乳腺癌细胞系（HMLE，数据未示出）得 到了证实。然后，我们评价了细胞系SUM159中CD44+CD24严细胞的比例，并且显示出94% 的该细胞表现出CSC表型。如果CSC中0AcGD2阳性细胞的百分比与在SUM159中确定的 非-CSC相当，则运样的百分比显示出在另一种乳腺癌细胞系（HMLE，数据未示出）中高5 倍。因此，对于在神经胶质瘤中获得的结果，0ACGD2在乳腺癌的CSC中富集并且能够用于 促进运些细胞的祀向。此外，运些结果非常有趣，因为其能够设想相对于祀向GD2治疗，祀 向0AcGD2治疗的治疗效力。事实上，祀向较小百分比的表达GD2的细胞并不能确保限制相 关癌症的扩散。
[0240] 用8B6杭体对到，腺痛细胸的存活率抑制 阳24U 发明人用抗-0AcGD2和抗-GD2抗体在乳腺癌SUM159细胞系上实施了细胞增殖测 定。 阳2创在37°C将104个SUM159细胞（100μL)于96-孔微板中解育24小时。加入来自 50μL培养基中的80-1. 25μg/mL抗体并在37°C解育24小时。向每个孔中加入50μg的 MTT并在37°C解育至少4小时，之后用10%SDS溶解细胞W中止MTT染料的细胞转化并在 37°C下O.N.解育。然后在570nm和650nm处读取吸光度。570nm处的吸光度减去650nm处 产物的吸光度（Ab巧70-Abs650)来计算染料的总转化率。用20μg依托泊巧处理的四个 对照孔提供了给出0%存活率的吸光度空白。存活率（％)被表示为相对于未处理细胞的 百分比，并且每个值表示为一式四份的平均+SEM。 阳243] 8B6抗体在该细胞系上诱导的直接细胞毒性达到30%的存活率抑制（图5)。
[0244] ·肺痛
[0245] 小细胞肺癌中0AcGD2神经节巧脂表达的评价 阳24引0肺痛细胸系中的0AcGD2表武 阳247] 在肺癌化96细胞系中评价了 0AcGD2表达。在双重巧光染色之后，通过流式细胞 术分析0AcGD2在人肺癌症干细胞中的表达谱。用一抗8B6、10B8和7肥（W10μg/ml)在 冰上在PBS-BSA1 %中解育细胞45分钟。在冰冻PBS中洗涂3次之后，用与山羊抗-小鼠 IgGOl+L) (JacksonResearch)缀合的FITC在冰上检测一抗结合抗体45分钟。接着，将细胞 固定于？。4 4%10分钟，然后用具有与4?0的抗-〔0133缀合物曲11*6117161〇*6(3)解育 25分钟。洗涂后，用ACScalibur流式细胞仪度D)利用Cell如est软件度D)来分析细胞。 在细胞系中测量至少IX1〇4个事件。 阳24引图6中示出了上述结果。
[0249] 结果再次示出了0AcGD2的表达和CD133的表达与超过50%的表达0AcGD2的CSC 细胞相关。运些细胞中GD2的表达稍高于阴性对照（即，7% )。 阳巧0] 而且，0ACGD2在小细胞肺癌的CSC中富集并且能够促进运些细胞的祀向。 阳巧1] ?白血病 阳252] 发明人利用8B6单克隆抗体实施了初步间接免疫巧光分析W评价0AC-GD2在急性 淋己细胞白血病（ALL)和急性髓细胞白血病（AML)中的表达。
[0253] 所测试的A化细胞系中的两个呈阳性。来自患者的一个AML样品也呈阳性。
【主权项】
1. 用于治疗癌症干细胞（CSC)癌的识别0-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体，或其功 能性片段，所述抗体包含： a) 轻链，至少包含来自免疫球蛋白的轻链可变区框架和由序列SEQIDNO:l、SEQID NO:2、SEQIDNO:3限定的三个互补决定区（CDRs)，其中序列SEQIDΝΟ:1限定CDR-L1，SEQ IDNO:2 限定CDR-L2,SEQIDNO:3 限定CDR-L3,和 / 或 b) 重链，至少包含来自免疫球蛋白的重链可变区框架和由序列SEQIDN0:4、SEQID NO:5、SEQIDNO:6限定的三个互补决定区（CDRs)，其中序列SEQIDN0:4限定CDR-H1，SEQ IDNO:5 限定CDR-H2,SEQIDNO:6 限定CDR-H3。2. 根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为权利要求1所述抗体的功能性片段， 其中所述片段选自包含Fab、Fab'、F(ab'）2、Facb、Fd、scFv、包括VHH片段和人VH片段的双 价抗体和单价抗体的组或由Fab、Fab'、F(ab'）2、Facb、Fd、scFv、包括VHH片段和人VH片段 的双价抗体和单价抗体组成的组。3. 根据权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。4. 根据权利要求1或3所述的抗体，其中，所述抗体包含包括氨基酸序列SEQIDNO: 7 的轻链可变区和包括氨基酸序列SEQIDN0:8的重链可变区。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌选自包含以下疾病的 组或由以下疾病组成的组：白血病、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺 癌、肝癌、膀胱癌或胃癌，其中所述白血病包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病， 所述神经胶质瘤包括胶质母细胞瘤。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌包含具有选自包含以 下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：⑶347⑶38、⑶347⑶19、 CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38 /CD19+、CD133+/CD38、CD133+/CD19、白细胞 介素-3-受体α+、CD33+、CD44+/CD24 /低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24is /-lin-/ALDH+、 CD133+、A2B5+、SSEA-Γ、CD133+/ESA* /CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/α2βΓ、CD44+、 Sca+/CD45-/Pecam/CD34+、ALDHl7〇ct47CD1337ABCG27CXCR4+、CD133+/CD44+、EpCAM+/ AFP+、EMA/CD44v6+、CD133+/CD44+/ALDH1+。7. 根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌包含至少具有⑶133+、 CD44+/CD24 /低、CD34+/CD38 或CD34 +/CD19+表型的细胞。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌为乳腺癌、神经胶质瘤、 急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中，所述CSC癌的特征在于癌症干细胞 的亚群中至少10%的癌症干细胞表达所述0-乙酰化的-GD2神经节苷脂。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，其中，所述抗体用于治疗CSC癌的一种 或多种转移和/或用于预防CSC癌的再发或复发。11. 权利要求1至10中任一项所述的抗体和至少一种其他的抗癌化合物作为组合制 剂，其分别、同时或相继用于CSC癌治疗中。12. 权利要求1至10中任一项所述的抗体与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗法和/ 或放疗联合，其分别、同时或相继用于CSC癌治疗中。13. 用于治疗CSC癌的药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至12中限定的 抗体。14. 根据权利要求13所述的药物组合物，其中，所述CSC癌选自包含以下疾病的组或由 以下疾病组成的组：白血病、乳腺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝 癌、膀胱癌或胃癌，，其中所述白血病包括急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，所述 神经胶质瘤包括胶质母细胞瘤。15.根据权利要求13至14中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌包含具有 选自包含以下表型的组或由以下表型组成的组中的至少一种表型的细胞：⑶347⑶38、 CD34+/CD19、CD34+/CD19+、CD34+/CD38+/CD19+、CD34+/CD38 /CD19+、CD133+/CD38、CD1337 CD19、白细胞介素-3-受体a+、CD33+、CD44+/CD24/低、CD44+/CD24-/ESA+、CD44+/CD24is /-lin-/ALDH+、CD133+、A2B5+、SSEA-Γ、CD133+/ESA* /CD44+、CD166+、CD26+、CD44+/CD133+/ a2βΓ、CD44+、Sca+/CD45-/Pecam/CD34+、ALDHl7〇ct47CD1337ABCG27CXCR4+、CD1337 CD44+、EpCAM+/AFP+、EMA/CD44v6+、CD1337CD447ALDH1+。16. 根据权利要求13至15中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌包含至少具 有CD133+、CD447CD24 严、CD347CD38 或CD34 +/CD19+表型的细胞。17. 根据权利要求13至16中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌为乳腺癌、神 经胶质瘤、急性髓细胞白血病或急性淋巴细胞白血病。18. 根据权利要求13至17中任一项所述的药物组合物，其中，所述CSC癌的特征在于 癌症干细胞的亚群中至少10%的癌症干细胞表达所述〇-乙酰化的-GD2神经节苷脂。19. 根据权利要求13至18中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于治 疗CSC癌的一种或多种转移和/或用于预防CSC癌的再发或复发。20. 权利要求13至19中任一项所述的药物组合物和至少一种其他的抗癌化合物作为 组合制剂，其分别、同时或相继用于CSC癌治疗中。21. 权利要求13至19中任一项所述的药物组合物与外科手术、化疗、激素疗法、靶向疗 法和/或放疗联合，在CSC癌治疗中分别、同时或相继使用。22. 用于诊断受试者中CSC癌的体外方法，其中，所述方法包括通过（i)确定0-乙酰化 的-GD2神经节苷脂的表达来分析获自受试者的生物学样品的步骤，并且其中所述0-乙酰 化的-GD2神经节苷脂在所述生物学样品中的表达是CSC癌的指征。 23. 0-乙酰化的-GD2神经节苷脂作为CSC癌的生物标志物的用途。24. 用于预测患有CSC癌的受试者对用权利要求1至12中任一项所述的抗体或权利要 求13至21中任一项所述组合物进行的治疗的应答的方法，其中，所述方法包括检测所述受 试者的生物学样品中表达0-乙酰化的-GD2神经节苷脂的细胞的存在。
【专利摘要】本发明涉及用于治疗癌症干细胞(CSC)癌的识别O-乙酰化的-GD2神经节苷脂的抗体。本发明进一步涉及用于治疗CSC癌的包含所述抗体的药物组合物和用于治疗对其有需要的患者中的CSC癌的方法，所述方法包括向所述患者给予所述抗体。本发明还涉及用于诊断CSC的方法和O-乙酰化的-GD2神经节苷脂作为CSC癌的生物标志物的用途。最后，本发明涉及用于预测患有CSC癌的受试者对用本发明的抗体或组合物进行的治疗的应答的方法。
【IPC分类】C07K16/30
【公开号】CN105339390
【申请号】CN201480033477
【发明人】斯蒂芬·比尔克莱, 丹尼斯·科绍诺, 米莱内·多维柳斯, 让-马可·勒·杜萨尔, 米奇卡尔·泰姆
【申请人】Ogd2药物, 南特大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年4月29日
【公告号】CA2910855A1, EP2992018A1, US20160068608, WO2014177271A1