压力=500。拉制的移液管头进行人工破碎并固定到化wport 微型机械手（型号MW3R)上，用于将巧成像分析法中确定的由吗I噪和粪臭素激活的嗅觉感 觉神经元分离。所激活的0SN通过施加到微量移液管后端的轻柔吸力而分离。
[0101] 神经元的mRNA按照liberwine法（MessageAmpIIaRNA试剂盒-Ambion,AM1751) 进行纯化和扩增。将所汇集的神经元在重悬缓冲液（SuperscriptIIICellsDirectcDNA 系统，46-6321-Invitrogen)中加热至75°C10分钟W打破细胞膜并使得其mRNA可用于扩 增。根据化erwine法（试管内转录）的线性扩增确保了所表达基因的相对转录水平的维 持。第一链cDNA根据Ambion试剂盒通过于42°C解育2小时获得。第二链cDNA的合成是 使用同一试剂盒通过于16°C进行2小时的第二次解育后进行的。使用双链cDNA作为模板， W生成相应的cRNA(于37°C解育14小时），然后将其纯化。重复运些cRNA合成步骤用于 第二次IVT。连续两轮过夜（14小时）的试管内转录产生足够量的cRNA;然后使用所扩增 的cRNAW产生Illumina化SeqcDNA文库。然后，通过下一代测序技术（NG巧获得整个转 录组的序列。 阳1〇引小鼠恶臭（特别是吗I噪和/或粪臭素）嗅觉受体的身份是通过将NGS结果与同一 物种的参照基因组序列进行比较而确定的。为此，将从NGS衍生的150个碱基对（通常称 为读数）的所得短序列相对于小鼠的参照基因组扣CSCversionMM9或MM10)进行比对， W建立运些细胞的全转录组。转录组数据的定量分析产生了所转录气味受体基因和它们各 自表达水平的列表。表现出丰度水平mRNA(丰度读数）的或存在于多于一个重复实验的气 味受体基因被认为是候选吗I噪和粪臭素受体并示于图3,其总结了来自4个独立粪臭素/吗I 噪细胞挑取实验的代表性NGS结果。条形代表目视检查后保留的具有最丰富mRNA的候选 吗I噪/粪臭素或基因。Y轴代表标准化为0MPmRNA水平的mRNA丰度水平，占每个样品挑取 的0SN的数量。星号（*)代表在超过一个实验中鉴定出的受体。0MP(嗅觉标记蛋白）是成 熟嗅觉神经元的特定生物标记。通过偶合巧成像和如上所述的NGS，如下5个受体序列被鉴 定为推定的小鼠吗1噪和粪臭素〇3:〇1化665(沈〇10^:9和沈〇10^:10)、01化740(沈〇 10側：1和沈910側：2)、01化741(沈910側：3和沈910側：4)、01化743(沈910側：5 和沈910側：6)^及01化745(沈910側：7和沈910側：8)。 阳103] 实施例3
[0104] 小鼠和人类恶臭受体的鉴定 阳1化]通过偶合巧成像和NGS(实施例1~2)进行的小鼠基因组中约1200个OR中5个 小鼠吗I噪和粪臭素OR的子集的鉴定使得能够通过计算机方法进行附加小鼠和新的人类吗I 噪和粪臭素OR的快速鉴定。由于具有相似总体氨基酸同一性的OR可能显示相似的气味响 应曲线[Adipietro et al. (2012)]，通过使用巧成像分离的吗I噪/粪臭素敏感嗅觉感觉神 经元的NGS分析而得到的小鼠OR序列来查询公共小鼠和人类基因组数据库而扩展了候选 吗I噪和粪臭素的OR列表。小鼠恶臭嗅觉受体的身份通过将NGS结果与同一物种的参照基 因组序列进行比较而确定。推定的恶臭受体将是嗅觉神经元衍生的NGS样品中最高丰度的 mRNA或存在于多于一个的独立的生物复制物，但不在缺乏响应恶臭的嗅觉神经元的对照样 品中。标准的生物信息学工具被用来确定与推定的哺乳动物（非人）恶臭受体最紧密相关 的人类气味受体，假定同源序列受体保留相似的功能（Adipietroetal. (2012))。使用了 BLAST?和/或BLASTN算法的默认参数。表1列出了所鉴定出的小鼠气味受体（OR)和预测 的人类直向同源物。 阳106] 表1 阳 107]
[0108] 相关的人类蛋白序列与表1中列出的由NGS鉴定出的小鼠OR序列具有至少60% 的序列同一性。同一性水平是在BLASTP算法之后相对于氨基酸序列的成对比较而给出的。 通过公共基因组数据库（默认参数）的BLASTP查询鉴定出二十六（26)个新的人类和小 鼠OR。十六（16)个与NGS来源的基因01化740(沈QIDN0:1和沈QIDN0:2)、7416EQ IDNO: 3 和沈QIDNO:4)、743(沈QIDNO: 5 和沈QIDNO:6)、745(沈QIDNO: 7 和沈QID NO: 8)紧密相关，并定义了 740家族。十（10)个与NGS衍生的受体01化665(SEQIDNO: 9 和SEQIDNO: 10)紧密相关，并定义了 01化665家族。图4描绘了候选小鼠吗I噪和粪臭素 OR基因和它们属于01化740 (图4A)和01化665 (图4B)受体家族的预测的人类直向同源物 的亲缘关系。该关系是通过蛋白质序列为基础的邻接进化树重建获得的。相应的人类直向 同源物用箭头表示。注释为假基因的人类OR基因名称来标记。假基因可能是非功 能性的。0R11H7P是一种具有已知功能性等位基因的分离式假基因（S巧。菱形（?)代表 最初由NGS鉴定出的受体。为了确定额外候选小鼠和人类吗I噪和粪臭素OR的氨基酸同一 性，将全长蛋白质序列在整个OR列表上基于高度保守氨基酸基序进行手动比对度ioedit 序列比对工具，版本7. 0. 5. 3)。表2显示了小鼠01化740家族和它们的预测人类直向同源 物的成对氨基酸同一性。表3显示了小鼠01化665家族和它们的预测人类直向同源物的成 对氨基酸同一性。 阳109] 表2
[0110] 小鼠740家族和人类直向同源物 阳 111]
[0112] 表 3
[0113] 小鼠01化665家族和人类直向同源物 阳114]
阳11引 实施例4 阳116] 肥K293T细胞中小鼠OR01化743、01化746和01化740的吗I噪和粪臭素活性
[0117] 候选小鼠受体01化740(沈9 10側：1和沈9 10側:2)、01化743(沈9 10側:5和 沈9 10^:6)^及01化746(沈9 10^:37和沈9 10^:38)对吗|噪和粪臭素恶臭二者的 活性通过基于细胞的cAMP分析方法得到确认。图5A和图5B中，标WFLAG化〇的（SEQID 18)01化743(沈9 10側:6)和01化740(沈9 10側:2)。0臟序列用0〇。1,(569 10側:21)进 行共转染，并暴露于增加浓度的吗I噪（左）或粪臭素（右）。图5C和图5D为重复实验，示出 了 01fr740(SEQIDN0:2)与01fr743(SEQIDN0:6)与吗I噪和粪臭素的相似活性。图祀中， 标^化46化〇(沈9 10 18)01化746(沈9 10側:38)。0臟序列用0〇。1,669 10側:21)进行 共转染，并暴露于增加浓度的吗I噪或粪臭素。气味诱导的活性是通过使用HTRF法（CisBio 试剂盒）测定胞液中的cAMP水平而检测的。对于全部Ξ种受体对于两种分子都示出了依 赖于剂量的受体活性的增加。单独（没有受体）使用Ga"if(SEQIDNO: 21)的肥K细胞的 共转染被用作非特异性活性的对照（对照）。活性被定义为归一化为实验中最高信号的基 线校正的HTRF比率。结果示于图5。所有Ξ种受体都显示出对于恶臭化合物的特异性剂量 依赖活性，因此验证了用于鉴定运些化合物的受体的方法。小鼠受体01化740(SEQIDNO: 1 和SEQIDN0:2)和01fr743(SEQIDN0:5和SEQIDN0:6)从响应于吗I噪和粪臭素二者的 分离的嗅觉神经元中被鉴定出。小鼠受体01化746(SEQIDNO: 37和SEQIDNO: 38)是使 用01fr740(SEQIDN0:2)和01fr743(SEQIDN0:6)作为查询序列通过数据库挖掘用计算 机方法鉴定出的。受体在它们的N-末端修饰WFLAG标签和牛视紫红质受体（SEQID18) 的前20个氨基酸，瞬时表达于肥K293T细胞，并分别用吗I噪和粪臭素刺激，W确认其作为 真正的吗I噪/粪臭素受体的身份。人类Ga亚基Ga"if(SEQIDN0:21)的共表达激活了Gs 的转导途径，在结合到合适的配体时导致内部cAMP的增加。结果确认了 01化740(SEQID 側：1和沈9 10側：2)、01化743(沈9 10側：5和沈9 10側：6)^及01化746(沈9 10側：37 和SEQIDNO: 38)作为吗I噪-粪臭素受体的身份。 阳11引实施例5 阳119] 肥K293T细胞中人类0尺52肥、0尺1162、0尺54〔2、0尺4(：15、0尺851、0尺11册和0尺11拟^ 及小鼠01化665和01化740的吗I噪和粪臭素活性
[0120] 候选人类吗I噪和粪臭素恶臭受体0R52N2(SEQIDN0:11和沈QIDN0:12)、 0R11G2(SEQIDN0:13 和SEQIDN0:14、0R5AC2(SEQIDN0:75 和SEQIDN0:76)、 0R4C15(SEQIDN0:79 和SEQIDN0:80)、0R8S1(SEQIDN0:83 和SEQIDN0:84)、 ORlme(SEQIDNO:15 和沈QIDNO:16)和 0R11H4(SEQIDNO:49 和沈QIDNO:50)W及 候选小鼠吗I噪和粪臭素恶臭受体01fr665(SEQIDN0:9和SEQIDNO10)和01fr740(SEQ IDNO: 1和SEQIDNO2)的活性是在基于细胞的巧通量分析方法中确认的（图6)。稳定 地共表达化0标记的人类0R52N2 (图6A、图她）或0R11G2 (图6C)和Gα15(SEQIDNO: 25) 的细胞暴露于增加浓度的粪臭素或吗I噪中。图6B是重复实验，显示出0R52N2与吗I噪和粪 臭素的相似活性。气味诱导的0R52N2或0R11G2活性是在暴露于气味物质之后通过测定最 大巧5染料（MolecularDevices)巧光变化而检测的。活性被定义为归一化为实验中最高 RRJ的基线校正的相对巧光单位（RRJ)比率。记录了依赖于剂量的受体活性的增加，并且 对于两种化合物都显示了相应的剂量-反应曲线。缺乏受体的细胞系，例如h0R52N2,被用 作高浓度的非特异性活性的对照（'吗I噪对照'和'粪臭素对照'）。活性被定义为归一化 为实验中最高R即的基线校正的相对巧光单位（R即）比率。鉴定出人类受体〇R52N2(SEQ IDNO: 11和沈QIDNO: 12)，运是由于其与小鼠01化665(沈QIDNO: 10)的序列相似性，后 者为从响应于吗I噪和粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的吗I噪/粪臭素受体。鉴定出人类 受体031162669 10^:13和沈9 10^:14)，运是由于其与小鼠01化740(沈9 10^:2) 的序列相似性，后者为从响应于吗I噪和粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的吗I噪/粪臭素受 体。运些受体被修饰^化〇序列，并稳定表达于肥Κ293T细胞。进一步的实施例显示了 人类受体 0R5AC2、0R4C15、0R8S1、ORime、0R11H4W及小鼠受体 01化665 和 01 化740(图 6〇-乃的吗|噪和粪臭素剂量-响应曲线。鉴定出人类受体0354〔2 669 10^:75和56〇10 N0:76)，运是由于其与小鼠01化207(SEQIDN0:78)的序列相似性，后者为从响应于吗I噪和 粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的受体。鉴定出人类受体(《4(：15 66〇10^:79和56〇10 N0:80)，运是由于其与小鼠01化1211(SEQIDN0:82)的序列相似性，后者为从响应于日引噪 和粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的受体。鉴定出人类受体0R8SUSEQIDN0:83和SEQ IDN0:84)，运是由于其与小鼠01化257(SEQIDN0:86)的序列相似性，后者为从响应于吗I 噪和粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的受体。鉴定出人类受体〇Rim6(SEQIDNO: 15和 SEQIDN0:16)，运是由于其与小鼠01化745(SEQIDN0:8)的序列相似性，后者为从响应于 吗I噪和粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的受体。鉴定出人类受体0R11H4(SEQIDNO:49和 SEQIDN0:50)，运是由于其与小鼠01fr746(SEQIDN0:38)的序列相似性，后者为从响应 于吗I噪和粪臭素二者的嗅觉神经元中分离的受体。从响应于吗I噪和粪臭素二者的嗅觉神经 元的NGS数据中直接鉴定出小鼠受体01化665(SEQIDNO: 9和SEQIDNO: 10)。从响应于 吗I噪和粪臭素二者的嗅觉神经元的NGS数据中直接鉴定出小鼠受体01化740(SEQIDNO: 1 和SEQIDNO: 2)。人类Ga亚基Ga15的共表达激活了Gq的转导途径，在结合到合适的配 体时导致内部Ca2+的增加。运些结果用于验证运里公开的方法对于恶臭化合物的哺乳动物 气味受体的快速可靠的鉴定是有用的。
[0121] 实施例6
[0122] 肥K293T细胞中吗I噪受体01化743活性的抑制
[0123] 一旦使用本文所描述的方法进行了鉴定，所得到的恶臭受体细胞系即可用于从化 学文库筛选能调节其活性并可能为人类所感知的化合物。本实施例在与实施例4相同的条 件下进行。用标记了化0的01化743(SEQIDNO:6)转染的细胞在存在或不存在300μΜ的 2-糞乙酬的情况下暴露于增加浓度的吗I噪。2-糞乙酬抑制01化743(SEQIDΝ0:6)对吗I噪 的活性。结果呈现于表4和图7。在括抗剂化合物的存在下，观察到在剂量-反应曲线中 的，导致了EC50对吗I噪增加为4倍。活性被定义为归一化为实验中最高信号的基线校正 的HTRF比率。运些结果表明，2-糞乙酬结合并抑制吗I噪受体的活性。
[0124] 表 4 阳1巧]
【主权项】
1. 一种鉴定被气味和/或芳香化合物激活的嗅觉受体的方法，包括： a) 从非人类哺乳动物物种中将含有天然嗅觉神经元的分离的嗅觉上皮解离成单个细 胞，其中每个神经元都表达嗅觉受体； b) 给嗅觉细胞加载指示剂染料，该染料允许测定嗅觉受体的恶臭受体结合活性； c) 使嗅觉受体与恶臭化合物接触； d) 测定由气味诱导的神经元活性的变化； e) 将被恶臭化合物激活的一个或多个嗅觉神经元分离； f) 扩增所分离的嗅觉受体的mRNA; g) 通过下一代测序技术对该mRNA的全部转录组的至少一部分进行测序；并且 h) 通过将该转录组的序列与同一物种的参考基因组序列进行比较，从而确定一组恶臭 嗅觉受体的同一性。2. 权利要求1所述的方法，还包括鉴定与权利要求1中鉴定出的恶臭嗅觉受体最相关 的人类受体。3. 权利要求1所述的方法，还包括修饰细胞系以表达至少一种权利要求1中鉴定出的 恶臭嗅觉受体。4. 权利要求2所述的方法，还包括修饰细胞系以表达至少一种权利要求2中鉴定出的 人类受体。5. 权利要求3所述的方法，还包括将该恶臭嗅觉受体与试验化合物相接触，以确定该 试验化合物是否结合至该恶臭嗅觉受体。6. 权利要求4所述的方法，还包括将该人类受体与试验化合物相接触，以确定该试验 化合物是否结合至该受体。7. -种分离的核酸，其与从由如下序列构成的群组中选出的核酸序列具有至少60% 的序列同一性：SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQ IDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQ IDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDN0:41、SEQIDNO:43、SEQ IDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDN0:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQ IDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQ IDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO77、SEQIDNO79、SEQ IDNO81、SEQIDNO83 和SEQIDNO85。8. -种分离的核酸，其与从由如下序列构成的群组中选出的核酸序列具有至少65% 的序列同一性：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQ IDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQ IDN0:33、SEQIDN0:35、SEQIDN0:37、SEQIDN0:39、SEQIDN0:41、SEQIDN0:43、SEQ IDN0:45、SEQIDN0:47、SEQIDN0:49、SEQIDN0:51、SEQIDN0:53、SEQIDN0:55、SEQ IDN0:57、SEQIDN0:59、SEQIDN0:61、SEQIDN0:63、SEQIDN0:65、SEQIDN0:67、SEQ IDN0:69、SEQIDN0:71、SE