发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及亚磷酰胺单体化合物，尤其涉及磷酸位置发色团修饰的脱氧核苷亚磷 酰胺单体化合物，本发明还涉及所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方 法及其制备的寡聚核苷酸探针及其在单碱基多态性检测以及目标基因或RNA检测中的应 用，属于功能化寡聚核苷酸领域。
【背景技术】
[0002] 核酸探针可以与DNA、RNA或蛋白质特异性结合，在化学、生物学和医学研究领域 有着广泛的应用，例如核酸纳米粒、生物芯片、mRNA成像、基因筛查和单碱基多态性（SNP) 检测等。其中，分子信标（MB)在这些领域应用最为广泛。传统意义上的分子信标是在核酸 序列两端分别标记荧光基团和淬灭基团，形成"发卡"状结构，荧光基团与淬灭基团在空间 上相互接近，无荧光发射；当和待检测的靶链特异性结合后，"发卡"结构打开，荧光基团与 淬灭基团相互远离，发射荧光。碱基组成、碱基错配位置和待分析靶链的长度等都会影响分 子信标的选择性和灵敏性。为了进一步优化核酸探针的检测性能，研究者设计了更多结构 复杂的分子信标，例如，基于核酸三联体的分子信标，哑铃结构的分子信标，基于核酸四链 体结构的分子信标和二元结构的分子信标。这些探针在很大程度上仍然依赖于和靶链整体 的碱基互补配对。
[0003] 为了识别核酸链中碱基配对的局部变化，可以将具有碱基识别作用的核苷定点插 入到核酸链的特点位置，从而设计出识别碱基的寡聚核苷酸荧光探针。根据已有的报道， 研究者通过以下方式设计了具有荧光效应的核酸碱基：（1)用荧光基团替换掉核苷上的碱 基，（2)通过柔性链或刚性链将荧光基团连接在嘧啶碱基的5'位置或嘌呤碱基的7'或8' 位置，（3)将荧光基团连接在糖环的不同位置。以上设计在不同程度上可以实现对局部碱 基错配的识别，但是除了个别设计识别效果非常明显（对于配对碱基和错配碱基，荧光强 度差别可以达到20倍以上），大多数设计对于错配碱基识别并不明显（荧光强度差别在几 倍到十倍的变化）。因此，有必要发展新的修饰策略。
[0004] 芘是一种重要的稠环芳烃类有机化合物，具有芳香性，有很强的荧光，可以作为染 料，在工农业生产和自然科学研究中应用广泛。将芘这一荧光团应用于核酸的化学修饰，弓丨 起了众多研究者的兴趣。目前已经报道的芘对寡聚核苷酸的修饰位点主要集中这些地方， 具体讲，芘可以通过以下方式连接在寡聚核苷酸上：（1)直接替换掉核苷的碱基；（2)将芘 通过柔性链或者刚性链连接在碱基上；（3)连接在糖环骨架上。不同的连接位置和连接位 置，对芘修饰的寡聚核苷酸的性质有着不同的影响。
[0005] 芘功能化的寡聚核苷酸探针在过去的十几年内获得了长足发展，目前在核酸序列 检测、碱基多态性识别和核酸高级结构，如G-四连体结构分析等方面获得了一定的应用。 目前已有的芘修饰寡聚核苷酸除了个别修饰策略在检测靶标核酸序列和区分单碱基多态 性上展现出了优异的性质外，绝大多数修饰策略是不能令人满意的，问题主要集中在以下 几个方面：
[0006] 首先，对靶标核酸序列的检测不够灵敏。例如，糖环骨架的2'位置进行芘修饰，在 和完全配对的RNA序列结合前后，荧光强度有20倍以上的增强。但是其他修饰策略，比如 碱基上芘荧光团的链接，使得在检测前后只有十倍或者更低的荧光强度变化。这样，在试剂 检测中，很容易造成假阳性的检测结果。
[0007] 其次，对单碱基多态性区分不够灵敏。很多疾病的发生和发展都是由于单碱基突 变造成的，例如人类恶性黑色素瘤的发生与V600E的T-A的单碱基突变密切相关，因此有 效检测单碱基突变的发生具有重要的意义。对于目前已有的芘修饰核酸探针，多数并不能 有效区分单碱基突变。例如，在糖环2'位置借助click反应，使用三氮唑作为连接臂连接 芘荧光团时，含有待检测的位点M(A)和突变位点MM(T)、MM(G)和MM(C)的序列和探针结合 后，几乎无明显区别。
[0008] 还有多数芘修饰寡聚核苷酸化学合成繁琐。在碱基上进行芘的荧光团连接时，往 往需要考虑碱基上氨基的保护和脱除，同时，在嘌呤碱基和嘧啶碱基上连接芘荧光团的策 略往往不具有通用性；在糖环上修饰时，糖环本身不含有可以进一步连接荧光团的基团，往 往需要特殊设计合成策略。
[0009] 因此，有必要对芘等荧光发色团修饰的寡聚核苷酸进行进一步的研究，以期找到 化学合成经济简易、具有通用性、对靶标核酸序列检测灵敏，同时又能有效区分单碱基多态 性的新的修饰策略。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的之一是提供一种发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物，该脱 氧核苷亚磷酰胺单体化合物的合成经济简易，用其制备的寡聚核苷酸探针具有通用性，对 靶标核酸序列检测灵敏，同时又能有效区分单碱基多态性；
[0011] 本发明的目的之二是提供所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制 备方法；
[0012] 本发明的目的之三是将所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物应用于 制备荧光寡聚核苷酸探针，并进一步将该荧光寡聚核苷酸探针应用于单碱基多态性检测、 目标基因或目标RNA检测等方面。
[0013] 为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
[0014] 本发明首先公开了一种发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物，其为式I所 示结构的化合物：
[0015]
[0016] 其中，R1为芘，茈或萘酰胺等发色团；
[0017] 所述Base选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤；
[0018] R2选自甲基，乙基或异丙基；
[0019] R3选自甲基，乙基或异丙基；
[0020] DMTr为对二甲氧基三苯甲基；η为1-8的任意整数，优选为1-6的任意整数，更优 选为1-4的任意整数。
[0021] 优选的，当R1为芘时，R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr 为对二甲氧基三苯甲基；η为1或4 ;
[0022] 当R1为茈时，R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr为对二甲 氧基三苯甲基；η为3 ;
[0023] 当R1为萘酰胺时，R2为甲基，乙基或异丙基；R3为甲基，乙基或异丙基；DMTr为对 二甲氧基三苯甲基；η为2。
[0024] 进一步优选的，本发明所述芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物，其为式II或 式III、式IV或式V所示结构的化合物：
[0025]
[0026]
[0027]本发明进一步公开了式III-式V化合物的中间体，其结构式分别为式VI-式IX所 示：
[0030] 本发明还公开了一种制备上述芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方 法，包括以下步骤：（1)将芘丁酸还原得到芘丁醇；(2)在无水、无氧环境和氮气保护下，将 芘丁醇与双二异丙基氨基氯化磷反应，得到芘修饰的亚磷中间体；（3)在无水、无氧环境、 氮气保护和催化剂存在的条件下，将芘修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得 到式III所示结构的芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。
[0031] 本发明还公开了一种上述芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法， 包括以下步骤：（1)在无水、无氧环境和氮气保护下，将芘甲醇与双二异丙基氨基氯化磷反 应，得到芘修饰的亚磷中间体；（2)在无水、无氧环境、氮气保护和催化剂存在的条件下，将 芘修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到式II所示结构的芘修饰的脱氧核苷 亚磷酰胺单体化合物。
[0032] 本发明公开了一种茈修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法，包括以下 步骤：（1)在无水、无氧环境和氮气保护下，将茈丙醇与双二异丙基氨基氯化磷反应，得到 茈修饰的亚磷中间体；（2)在无水、无氧环境、氮气保护和催化剂存在的条件下，将茈修饰 的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到式IV所示结构的茈修饰的脱氧核苷亚磷酰 胺单体化合物。
[0033] 本发明还公开了一种萘酰胺修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法，包 括以下步骤：（1)在无水、无氧环境和氮气保护下，将N，N_二甲胺基萘酰胺基乙醇与双二异 丙基氨基氯化磷反应，得到萘酰胺修饰的亚磷中间体；（2)在无水、无氧环境、氮气保护和 催化剂存在的条件下，将萘酰胺修饰的亚磷中间体和DMT保护的脱氧核苷反应，得到式V 所示结构的萘酰胺修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。
[0034]本发明上述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法中，所述催化 剂为四氮唑；所制备得到的活泼的芘修饰的亚磷中间体不经进一步纯化，可以直接和5'位 置DMT保护的脱氧核苷酸反应，之后快速柱层析分离。其中，所述脱氧核苷酸选自胸腺嘧啶 脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸或鸟嘌呤脱氧核苷酸中的任意一种。
[0035] 本发明所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物能够应用于制备寡聚 核苷酸探针。
[0036] 将本发明所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物定点插入到寡聚核苷 酸的相应位置，可以通过DNA合成仪直接应用于寡聚核苷酸的固相合成，在进行偶合时，延 长偶合时间至300s，偶合效率与天然的DNA亚磷酰胺单体一致，之后经过新鲜氨水的切割 脱保护和高效液相的分离纯化，最终得到磷酸位置芘修饰的荧光寡聚核苷酸探针。
[0037] 本发明进一步公开了一种荧光寡聚核苷酸探针，含有发色团修饰的脱氧核苷亚磷 酰胺单体化合物；所述荧光寡聚核苷酸探针中，发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合 物为1个或1个以上；所述的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物位于寡聚核苷酸链的任意位置， 优选为位于寡聚核苷酸链的中部。
[0038] 本发明得到的寡聚核苷酸荧光探针本身没有荧光发射，当与完全配对的靶链结合 后，发射荧光，强度增强非常显著，最高达到23. 5倍。本发明将芘等发色团定点修饰在寡聚 核苷酸的磷酸位置，不影响寡聚核苷酸的稳定性和二级结构，可以应用于基因的单碱基多 态性检测。
[0039] 本发明结合计算