一种从赤霉菌转化dhea的发酵液中分离纯化其羟化产物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从发酵液中提取分离生物转化产物的方 法，即利用赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3-l转化底物去氢表雄酮为7α-羟基-去 氢表雄酮和三羟基雄留烯酮，从其发酵液中提取分离并纯化产物。
【背景技术】
[0002] 去氢表雄酮（DHEA)是生物体内重要的活性物质，对生命的代谢活动有重要的调 节作用，其在生物体内能被氧化生成7α-羟基-去氢表雄酮（7a-0H-DHEA)和三羟基雄甾 烯酮（7α，15a-diOH-DHEA)，后者是前者在生物体内的进一步氧化代谢产物。目前，有研究 发现7a-0H-DHEA具有增强免疫力，抗糖皮质激素和减肥的功效，还对癌症和阿尔茨海默 病具有一定的疗效；而7α，15a-diOH-DHEA是"第四代"口服避孕药有效成分屈罗酮的前 体，屈罗酮与低剂量的炔雌醇配伍，是一种新型的女用口服避孕药称优思明，优思明自2000 年已成为全球销量第一的女用口服避孕药。DHEA的羟基化产物作为具有重要药理作用和药 用价值的留体化合物，应用前景十分看好，成为当前药物研究领域中的热点之一。
[0003] 与传统的化学合成法相比，利用微生物转化DHEA具有反应步骤少、选择性高、条 件温和、公害少等多种优势，所以近年来微生物转化法已成为留体中间体合成的主要趋势。 在能转化DHEA的丝状真菌中，赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3_l具有较好的转化能 力。但是由于微生物转化DHEA的羟化反应是在胞内进行，转化结束后产物在胞内和胞外都 有分布，利用传统方法直接进行提取，产物有较多的损失。此外，在实际工业生产中，考虑到 底物的成本较高，通常会回收底物再次进行投料，因此研究产物的分离提取工艺是十分必 要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3-1转化底物 DHEA的发酵液中有效提取并分离其羟化产物的方法，主要针对粗产物的提取、柱层析分离 和产物结晶这三个环节来改良传统的产物分离提取工艺，以达到选择有效低毒试剂、降低 试剂用量和提高产物收率的目的。
[0005] 本发明是利用一株赤霉菌（Gibberellaintermedia)CA3-1 (中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 4903)转化DHEA为7a-0H-DHEA和 7α，15a-diOH-DHEA。转化结束后，为了提高萃取效率，先对发酵液进行预处理，然后固液 分离，分别对上清与沉淀萃取，再合并萃取液浓缩得粗品。将粗品经柱层析分离后重结晶即 得纯品。
[0006] 本发明方法其具体步骤如下：
[0007] (1)发酵液的预处理：收集转化结束后的发酵液，用一定的方法进行预处理。
[0008] (2)产物的粗提：经过步骤（1)中的方法处理后，将发酵液离心，用等体积的疏 水性有机溶剂和亲水性有机溶剂分别萃取上清和沉淀。合并萃取后的有机溶剂，加入 0. 3-0. 5%的活性炭进行脱色，然后用旋转浓缩仪进行浓缩，即得到粗提物。
[0009] (3)产物的分离：将步骤⑵中得到的粗提物用甲醇复溶，利用Grace RevelerisTMFlash色谱系统中的蒸发光散射检测器检测产物和底物的出峰情况，同时采 用外接的硅胶柱进行产物的分离纯化。
[0010] 其中，步骤（1)中涉及到的预处理方法有1)调pH处理：取转化液于离心杯中，通 过酸碱调节，分别将转化液的pH值调节为3~11。混合均匀，离心，固液分离后进行转化液 的粗提；2)加热处理：取转化液于离心杯中，置于60°C~80°C水浴锅中加热10~20min。 混合均匀，离心，固液分离后进行转化液的粗提；3)超声处理：取转化液于离心杯中，放入 超声振荡仪中超声5~20min，超声功率为480W。混合均匀，离心，固液分离后进行转化液 的粗提；4)化学破碎法处理：取转化液于洁净的离心杯中，加入1%~10% (v/v)事先配置 的细胞破碎剂反应5~20min。离心，固液分离后进行转化液的粗提。其中细胞破碎剂为乙 醇：氢氧化钠溶液（1M~5M) = 1:1~5:1 (v/v)。表1对以上预处理方法的效果进行了评 价，最终选择加入体积百分比为1 %~10%事先配置的细胞破碎剂，混合均匀，60°C~80°C 水浴加热10~20min，超声处理5~15min的方法对发酵液进行预处理。
[0011] 表1预处理效果评价
[0012]
[0013] 步骤（2)中所述的疏水性有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚或正己 烷，亲水性的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮，优选乙酸乙酯和乙醇，至少萃取两遍。表2对不 同萃取剂的效果进行了评价。用等体积的乙醇和乙酸乙酯分别萃取沉淀和上清各2遍，粗 提物收率可达到95. 8%。
[0014] 表2不同萃取剂对沉淀和上清的萃取效果比较
[0015]
[0016] 步骤（3)中利用GraceRevelerisTMFlash色谱系统的外接硅胶柱进行产物的分 离纯化时，所用的洗脱剂为氯仿：甲醇（v/v) = 5:1~15:1 ;二氯甲烧：乙醇（v/v) = 5:1~ 15:1 ;氯仿：乙醇（v/v) = 5:1~15:1 ;二氯甲烧：甲醇（v/v) = 5:1~15:1 ;二氯甲烧：乙 醇（v/v) = 5:1~15:1以及70%、90%、100%的乙醇或100%的甲醇，优选二氯甲烷：乙醇 (v/v) =15:1。
[0017] 采用本发明所述的产物分离提取方法，纯化总收率可达到91. 3%，较文献报道的 提高了 5 %，产物 7a-0H-DHEA和 7α，15a-diOH-DHEA纯度分别可达 97. 4 %、98 %。同时 该产物分离提取方法中选择了较为环保的乙醇和乙酸乙酯，减少了有毒试剂的使用。
【附图说明】
[0018] 图1为发酵液预处理中采用化学破碎法时细胞破碎剂的添加量对粗提物收率的 影响。
[0019] 图2为萃取剂的用量对沉淀和上清中粗提物收率的影响。
【具体实施方式】[0020] 实施例1
[0021] 收集底物投料浓度为10g/L，转化率为81. 3 %的发酵液1L于离心杯中，添加 4% (v/v)的氢氧化钠-乙醇溶液，混匀后70°C加热15min，再放入超声振荡仪中超声处 理15min，超声功率为480W。混合均匀，8000r·min1下离心5min分离上清液和沉淀。沉 淀用等体积的乙醇萃取2遍，上清先后用1倍体积和0. 5倍体积的乙酸乙酯进行萃取