的短小芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及短小芽孢杆菌，特别是涉及一种用于降解黄曲霉毒素Mi的短小芽孢杆 菌及其所分泌的活性蛋白。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF)是由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉所产生的一类结 构和理化性质相似的毒性极强的次生代谢产物。目前已经发现黄曲霉毒素 皿2等20余种。AFB挪AFM斤1993年和2002年分别被世界卫生组织国际癌症研究机构确 定为I类致癌物。AFMi主要是由动物食用了含有AFBj9饲料后，在体内通过代谢转化而来， 因此主要出现在动物源性食品，例如奶及奶制品中。2011年某乳业生产的某一批次乳制品 中检测出量超标，其危害远远大于三聚氰胺，由此AFMi引起了消费者和研究人员的 注意。目前控制AFMi的方法只是通过控制它的前体物质AFB在饲料中的含量，减少转化来 防止AFMJi奶制品的污染，而当奶和奶制品中已经出现了AFMi时却没有有效的办法来去 除。
[0003] 目前，用于降解黄曲霉毒素的方法主要包括理化法和生物法。理化法一般包括萃 取法、吸附法、热处理法、辐射法、碱、氧化剂等，虽在降解黄曲霉毒素上具有一定效果，但是 不可避免地会对食品或饲料的营养成分、品质造成破坏，同时还可能产生副产物和化学试 剂残留，从而造成一定危害。生物去毒法利用抑制黄曲霉毒素的产生或利用微生物吸附、降 解黄曲霉毒素，其条件温和，既不会破坏产品的营养成分，也不会产生副产物及化学残留， 主要包括吸附去毒和降解去毒两方面。吸附去毒法由于吸附过程是可逆的，菌体培养时间 过长时还会向基质中释放一部分毒素，在生产应用中效果不稳定，而微物降解法通过破坏 黄曲霉毒素结构，将其转化为无毒或低毒的物质，降解过程不可逆，去毒效果稳定彻底，是 一种更理想的方法。因此，筛选高效降解黄曲霉毒素的菌株，具有积极的现实意义。
[0004]目前利用微生物降解黄曲霉毒素的报道多集中在AFBi，例如：例如申请号 200810224726. 8,公开号CN101457212A"一株同时降解黄曲霉毒素队、赭曲霉毒素A的菌株 的筛选、培养和应用"，申请号200910087595. 8,公开号CN101580810A"一种筛选降解黄曲霉 毒素队细菌的方法"，申请号200910092920.X，公开号CN101659929A的专利"用于降解黄曲 霉毒素队的粘球菌菌株及其活性蛋白"，申请号201210017977. 5,公布号CN103215191A"一 株平菇及其在降解黄曲霉毒素中的应用"，申请号201410001901. 2,公布号CN103725636A 的专利"用于降解黄曲霉毒素队的芬氏纤维微菌SLAQ001及其应用"等，另外也有一些利用 微生物降解多种黄曲霉毒素的报道，申请号201010539983. 8,公开号为CN102031234A的专 利"用于降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其分泌的活性蛋白"，申请号201410001212. 1，
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于降解黄曲霉毒素乂的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)，其保藏号为CGMCCNO. 10228,及其所分泌的活性蛋白。
[0006] 本发明所提供的短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus)是从食草动物奠便筛选得到。
[0007] 本发明的另一目的是提供上述短小芽孢杆菌的培养方法及其所分泌的活性蛋白 的制备方法。
[0008] 本发明的进一步目的是提供上述短小芽孢杆菌及其所分泌的活性蛋白在降解黄 曲霉毒素I中的应用。
[0009] 所述短小芽孢杆菌是从食草动物粪便分离并筛选得到的Bacilluspumilus E-l-1-1，通过微生物菌落形态观察，16SrDNA分子测序以及Biolog生理生化实验对其进行 了鉴定。
[0010] 其细菌生理生化特征见表1 :
[0011] 表L细菌生理生化特征
[0012]
[0013]
[0014] 注：" + "表示阳性，""表示阴性，" / "表示半阳性
[0015] 本发明还提供所述短小芽孢杆菌的培养方法，取所述短小芽孢杆菌种子液以3% 的接种量接种到lOOOmL培养基中进行摇瓶发酵培养。
[0016] 其中，所述短小芽孢杆菌种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件 相同。
[0017] 在发酵时，该短小芽孢杆菌的最佳碳源为麦芽糖，最佳氮源为酵母粉。
[0018] 在本发明具体方案中，所述培养基由如下组分组成：麦芽糖6g、酵母粉8g、氯化钠 l〇g、蒸馏水l〇〇〇mL，pH值为7. 0-7. 4。所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度为35-45°C，发酵 时间 14-16h，pH值 7. 0-7. 4,转速 100-150r/min。
[0019] 本发明还提供所述短小芽孢杆菌，其保藏号为CGMCCNO. 10228及所分泌的活性蛋 白，其通过以下方法制备得到：
[0020] (1)对短小芽孢杆菌进行发酵培养；
[0021] (2)发酵结束后，离心除菌体，用60% -80%硫酸铵提取上清液中的活性蛋白，沉 淀，5000r/min离心20min得到蛋白沉淀；
[0022] (3)将得到的蛋白沉淀溶于PBS缓冲液，冻干浓缩即得活性蛋白。
[0023] 本发明还提供所述短小芽孢杆菌（保藏号为CGMCCN0. 10228)及其所分泌的活 性蛋白在降解黄曲霉毒素1中的应用。本发明还提供利用上述短小芽孢杆菌（保藏号为 CGMCCN0. 10228)及其所分泌的活性蛋白降解黄曲霉毒素I的方法，取所述短小芽孢杆菌 的发酵液或所述活性蛋白的PBS溶液900μL，加入黄曲霉毒素I溶液100μL。将反应体 系的pH值调节为5. 0-7. 5,在35-45°C，12h后对溶液中的AFMjfl减率分别达到90%以上 和80%以上。
[0024] 本发明提供的短小芽孢杆菌可以在相对简单的培养条件下降解AFMi，并且本发明 提供的降解AFMi的方法，操作简便、条件温和，反应时间短，降解效果显著。
【附图说明】
[0025]图1为短小芽孢杆菌菌株在保藏培养基上的菌落形态图；
[0026] 图2为短小芽孢杆菌菌株在显微镜下的菌体形态图；
[0027] 图3为对照组黄曲霉毒素吣色谱图；
[0028] 图4为短小芽孢杆菌处理组黄曲霉毒素乂色谱图。
[0029] 保藏信息说明
[0030] 本发明所述的短小芽孢杆菌BacilluspumilusE-1-1-1，已于2014年1