一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSnRK及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白 AsSnRK及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件对我国小麦造成的减产约800亿公斤，严重影响着小麦的 产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从 分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因 表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。
[0003] 近年来，通过蛋白激酶的结构与功能分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控 的机理得到了广泛关注。蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族（SnRKs)在植物的许多生理过程中 起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等 [45 48]。SnRK蛋白激 酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不同，被 分为三个亚家族分别是：SnRKl，SnRK2和SnRK3。SnRK蛋白激酶三个亚家族都有相似的结 构特点，N-端都有一段能与其他蛋白相互作用的激酶结构域，并且结构在三个家族中是高 度变化的。
[0004] 第一个SnRK2成员是从ΑΒΑ处理的小麦胚胎cDNA文库中分离得到的PKABA1， PKABA1的表达除受ΑΒΑ和干旱胁迫所诱导。SnRK2家族基因在功能上表现出一定的差异性， 拟南芥中SnRK家族成员中有9个基因被高渗胁迫（甘露醇或NaCl)诱导，5个基因被ΑΒΑ 诱导，但均不受冷胁迫诱导。拟南芥SnRK2. 6基因通过参与调控主要的新陈代谢过程和ΑΒΑ 途径来控制气孔的开度。水稻中SnRK基因，通过蛋白磷酸化分析表明所有成员都能被高渗 胁迫激活，但是只有0sSAPK8、0sSAPK9和OsSAPKIO这三个基因受ΑΒΑ诱导表达。小麦中 得SnRK2家族基因在功能上也有一定不同，在拟南芥中过表达TaSnRK2. 4基因可以明显增 强植物的抗逆性；TaSnRK2. 7基因功能分析显示，在糖代谢、降低渗透势、增强光系统II的 活性以及促进植物生根等生理生化过程中起着重要作用；过表达TaSnRK2. 8基因的拟南芥 对干旱、低温、高盐等胁迫均有一定耐性。因此，利用抗旱、耐盐的燕麦克隆、分离抗逆相关 SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性，对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用 和经济效益，具有非常重要应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSnRK。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋AsSnRK的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组细胞。
[0009] 本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSnRK的应用。
[0010] 本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白AsSnRK，来源于燕麦，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。
[0011] 本发明的蛋白激酶由360个氨基酸残基组成，是SnRK类蛋白激酶。自SEQIDNO. 1 的氨基末端第25-40位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQIDNO. 1的第128-142位氨基酸 残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。
[0012] SEQIDNO. 1
[0013]
[0014] 为了使蛋白AsSnRK便于纯化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白 质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1标签的序列
[0016]
[0017] 根据本发明所公开的SEQIDNO. 1序列，本发明的转录因子AsSnRK可人工合成， 也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0018] 根据本发明的AsSnRK编码基因具有如SEQ ID N0. 2所示cDNA序列。
[0019]SEQIDNO. 2
[0022] 含有AsSnRK基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明 的保护范围。
[0023] 可用现有的植物表达载体构建含有AsSnRK基因的重组表达载体。
[0024] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因3'端转录 的非翻译区均具有类似功能。
[0025] 使用AsSnRK构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构 建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以 是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0026] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0027] 本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。
[0028] 本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有AsSnRK基因的重组 表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。
[0029] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SnRK 蛋白激酶AsSnRK基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的 转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植 物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞 或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以 是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、燕麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿 等。
[0030] 本发明以抗旱、耐盐性较强的燕麦（AvenasativaL.)为实验材料，得到了抗逆相 关的AsSnRK蛋白及其编码基因，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发 明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分 子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
[0031] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
【附图说明】
[0032] 图1为T1代AsSnRK转基因烟草株系的鉴定。M:marker;1 :阴性对照；2 :水对照； 3~11 :不同转基因烟草株系。
[0033] 图2为转基因烟草耐旱性鉴定。CK是野生型烟草，L1、L2、L3是3个独立的AsSnRK转基因烟草株系。
[0034] 图3转基因烟草耐盐性鉴定。CK是野生型烟草，Ll、L2、L3是3个独立的AsSnRK 转基因烟草株系。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0036] 以下的实施例便于更好